Lgr5在干細胞及腫瘤中的研究進展

戴夢源，陳 晨(綜述)，陶澤璋(審校)

(武漢大學(xué)人民醫(yī)院耳鼻咽喉-頭頸外科，武漢 430060)

近年來，干細胞的研究加深了人們對腫瘤發(fā)生、發(fā)展的認識，很多腫瘤的發(fā)生都與干細胞相關(guān)。干細胞標志物成為目前研究的熱點，研究證實Lgr5在人體小腸底部隱窩基底柱狀細胞、結(jié)腸隱窩、胃腺體底部及毛囊中均有不同程度的表達,其可作為多種人體組織干細胞的標志物。此外，研究證明Lgr5與腫瘤的發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān)[1]。

1 Lgr5的結(jié)構(gòu)特點

Lgr5,即富含亮氨酸重復(fù)序列G蛋白偶聯(lián)受體5(leucine-rich repeat-containing G protein-coupled receptor 5)，又名GPR49、HG38、FEX、GPR67和MGC117008，是G蛋白偶聯(lián)受體家族的成員之一[1]。Lgr5多肽鏈的外功能區(qū)有17個富含亮氨酸的重復(fù)序列，N端和C端尾部側(cè)翼富含半胱氨酸序列以及高度保守的7次α螺旋跨膜區(qū)[2]。

Lgr5廣泛分布于人體組織中，在大腦、脊髓、毛囊、乳腺、眼睛、胃腸道及生殖器官等均有表達[1-2]。目前發(fā)現(xiàn)家族蛋白R-spondins(RSPOs)為孤受體Lgr4、Lgr5的生理性配體，結(jié)合后可強化Wnt/β聯(lián)蛋白信號通路，在胚胎發(fā)育和成體干細胞自我更新及維持中起著重要作用[3]。研究表明，Lgr5是多種組織成體干細胞的標志物，并與腫瘤的形成密切相關(guān)[4]。

2 Lgr5是成體干細胞的新標志物

2.1Lgr5作為小腸干細胞標志物 小腸干細胞通過隱窩分裂的方式來實現(xiàn)增殖。Gregorieff等[5]的研究表明，鼠類小腸不斷自我更新的上皮組成了隱窩及小腸絨毛。腸隱窩是單克隆的，每一隱窩都起源于各自的腸干細胞。干細胞通過不對稱分裂有規(guī)律地產(chǎn)生短暫增殖細胞，從而分化為各個類型的小腸上皮細胞。在過去十年中，許多小腸干細胞標志物被相繼提出，Lgr5是最新研究的小腸干細胞標志物[6]。

Wnt信號通路對調(diào)節(jié)成人腸道上皮細胞動態(tài)平衡有關(guān)鍵作用。Barker等[7]設(shè)想一些Wnt/β聯(lián)蛋白的目標基因也許特異性的表達于干細胞上，研究發(fā)現(xiàn)Lgr5在小腸隱窩基底柱狀細胞(crypt base columnar cell，CBC)過度表達，體外培養(yǎng)進一步發(fā)現(xiàn)Lgr5+CBC能形成人類所有類型的腸上皮細胞，表明Lgr5可能是小腸干細胞的特異性分子標志物。Yui等[8]在體外實驗中發(fā)現(xiàn)，單個Lgr5+干細胞來源的類器官移植物可在小鼠體內(nèi)形成功能和組織學(xué)正常的自我更新的隱窩，并觀察到移植物在體外大量擴增。Lgr5+CBC具有自我更新特性，是小腸的干細胞[9]。

小腸隱窩基底切片顯示，Lgr5+CBC和終末分化的旁氏細胞有顯著的對稱性[5]。形態(tài)學(xué)上，Lgr5+CBC的特點是稀少的細胞質(zhì)和楔形的核，均朝向隱窩腔，很容易與毗鄰的旁氏細胞相區(qū)別[10]。Sato等[11]研究發(fā)現(xiàn)，旁氏細胞表達表皮生長因子、腫瘤壞死因子α、Wnt3以及Notch配體CD114等干細胞生長所必需的信號。干細胞和旁氏細胞共同培養(yǎng)顯著地促進了結(jié)腸類器官的形成。在體內(nèi)，隨著旁氏細胞的凋亡，Lgr5+干細胞的數(shù)量出現(xiàn)了大幅度降低。目前研究發(fā)現(xiàn)，在小腸上皮中旁氏細胞是Lgr5+干細胞壁龕的關(guān)鍵組成部分[11]。

2.2Lgr5+細胞與結(jié)腸干細胞 結(jié)腸干細胞位于結(jié)腸黏膜的隱窩基底部，其功能為維持結(jié)腸黏膜上皮的正常再生。以往的研究表明，CD133是結(jié)腸干細胞的標志物[12]。Barker等[7]的研究發(fā)現(xiàn)，Lgr5+細胞局限性表達于結(jié)腸隱窩底部，可自我更新并分化成為黏膜所有的細胞類型。通過長期跟蹤觀察LacZ轉(zhuǎn)基因小鼠發(fā)現(xiàn)，上皮所有細胞類型均表達在Lgr5+細胞組成的綠色克隆區(qū)，這一區(qū)域的細胞具有多潛能性，由此推測Lgr5+細胞代表了結(jié)腸上皮的永久干細胞；此實驗還發(fā)現(xiàn)，標記的結(jié)腸隱窩干細胞幾乎都局限性表達于基底部，由此推測小腸干細胞比結(jié)腸干細胞活躍[13]。

2.3Lgr5+細胞與毛囊干細胞 基因微陣列分析顯示，Lgr5 mRNA高度表達于毛囊上段的隆突區(qū)，即皮脂腺開口處和立毛肌附著處的毛囊外根鞘，與毛囊生長密切相關(guān)[14]。Vander Flier等[15]發(fā)現(xiàn)，從毛囊隆突區(qū)分離得到的表達Lgr5的細胞是一種活躍增殖并且具有多分化潛能的干細胞群，可在移植后形成毛囊、皮脂腺和表皮。Barker等[7]通過譜系追蹤試驗也證實了Lgr5+細胞代表了毛囊的長期干細胞，在毛發(fā)周期過程中對毛發(fā)的循環(huán)再生起著重要的作用。Lgr5是周期性、長期存在的毛囊干細胞標志物。

2.4Lgr5+細胞與胃干細胞 胃干細胞主要位于峽部及腺體基部與上皮表面之間，但是目前還未發(fā)現(xiàn)明確的干細胞標志物。Gregorieff等[5]在幽門腺體基底部發(fā)現(xiàn)了可自我更新并多向分化的增殖Lgr5+細胞，譜系追蹤表明整個腺體來源于Lgr5+細胞。

2.5Lgr5+細胞與乳腺干細胞 目前還未發(fā)現(xiàn)乳腺干細胞確切的標志物。Ginestier等[16]發(fā)現(xiàn)，乳腺干細胞定位于末端導(dǎo)管小葉單位；Sleeman等[17]的研究則顯示干細胞位于基底上皮層；Gregorieff等[5]的研究發(fā)現(xiàn)Lgr5表達于乳腺基底上皮層。Lgr5能否作為乳腺干細胞標志物還需進一步研究來證實。

小腸、結(jié)腸和胃起源于內(nèi)胚層，皮膚、乳腺起源于外胚層，由此可見Lgr5是橫跨胚層的干細胞標志物，也許能代表成體干細胞的普遍標志物。

3 Lgr5在腫瘤組織中的表達

目前研究發(fā)現(xiàn),Lgr5在正常人體組織中的表達呈局限性,而在胃腸道、卵巢、肝臟及基底細胞癌等腫瘤組織中,Lgr5的表達均有不同程度的升高[5]。

3.1Lgr5在胃腸道腫瘤中的表達 Becker等[18]采用免疫染色法比較胃腸道正常組織和癌前病變組織發(fā)現(xiàn)，在癌前病變組織中Lgr5的表達水平顯著高于正常組織，且在正常胃腸組織中Lgr5的表達局限于隱窩基底部，而在癌前病變組織中Lgr5表達并不僅局限于隱窩基底部。由此可知，Lgr5離開隱窩基底部是腫瘤形成和惡化的早期事件，Lgr5對腫瘤的發(fā)生可能有重要作用。與之相似，結(jié)腸腫瘤的免疫組織化學(xué)結(jié)果顯示,Lgr5在正常結(jié)腸組織中呈陰性或弱陽性表達，而在結(jié)腸腫瘤中則呈現(xiàn)強陽性表達,高水平的Lgr5表達可能與胃腸道腫瘤的形成密切相關(guān)[19]。

3.2Lgr5在肝癌中的表達 Lgr5在肝細胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)組織中的表達水平顯著上調(diào)。Yamamoto等[19]通過反轉(zhuǎn)錄聚合酶連反應(yīng)發(fā)現(xiàn)，Lgr5 mRNA在HCC組織中的表達顯著高于非肝癌組織，在含有β聯(lián)蛋白外顯子3突變的HCC中，Lgr5基因過表達率達到了87.5%；把突變的β聯(lián)蛋白導(dǎo)入小鼠肝細胞中也可引起小鼠Lgr5表達上調(diào)。由此推測，在肝癌中Lgr5很可能是被Wnt信號途徑激活的目標基因，Lgr5可能與肝癌的形成和發(fā)展有一定聯(lián)系。

3.3Lgr5在基底細胞癌中的表達 Tanese等[20]采用DNA微陣列分析人類基底細胞癌(basal cell carcinoma，BCC)病例，發(fā)現(xiàn)Lgr5在所有基底細胞癌病例中的表達均顯著上調(diào)；反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，BCC病例中Lgr5 mRNA表達上調(diào)率為95%(19/20)；敲除小鼠BCC細胞株的Lgr5基因，則可顯著抑制BCC細胞的增殖。人類永生角質(zhì)HaCaT細胞中Lgr5過表達可誘導(dǎo)細胞增殖，而把Lgr5過表達的HaCaT細胞移植到免疫缺陷小鼠則可誘發(fā)腫瘤形成。Lgr5基因可導(dǎo)致細胞的快速增殖，與腫瘤組織的形成有著十分緊密的聯(lián)系。

3.4Lgr5在食管病變中的表達 Becker等[7]對食管樣本的研究發(fā)現(xiàn)，Lgr5在Barrett食管中表達率增加(70%)，在高級不典型增生和食管腺癌中的表達率幾乎達到100%。實驗還發(fā)現(xiàn)，Lgr5的高表達率與食管腺癌不良預(yù)后獨立相關(guān),提示Lgr5有作為Barrett食管、不典型增生和食管腺癌生物學(xué)標記的潛能，是癌前病變及腫瘤的潛在生物學(xué)標志物。

3.5Lgr5在其他腫瘤中的表達 Nakata等[21]研究表明，腦膠質(zhì)細胞瘤中Lgr5轉(zhuǎn)錄水平增高，其利用免疫熒光染色確定了CD133-和Lgr5+細胞在膠質(zhì)母細胞瘤中的共同定位。在功能上，由慢病毒介導(dǎo)的Lgr5基因敲除誘導(dǎo)了腦膠質(zhì)細胞瘤成體干細胞的凋亡。Lgr5的消耗還導(dǎo)致了L1細胞黏附分子的表達下調(diào)。此外，在腦膠質(zhì)瘤的發(fā)生中，Lgr5的表達增加與膠質(zhì)瘤的進展及不良預(yù)后相關(guān)。

Swetlana等[22]檢測77例軟組織肉瘤患者組織切片中野生型Lgr5和GPR49Δ5(缺少外顯子5的Lgr5剪接變異體)的mRNA水平，發(fā)現(xiàn)GPR49Δ5mRNA低表達與軟組織肉瘤的不良預(yù)后和短期無復(fù)生存率顯著相關(guān)，同時，GPR49Δ5mRNA低表達的患者比高表達的患者平均發(fā)病年齡晚7.5年，顯示了GPR49Δ5表達在軟組織肉瘤的發(fā)生和進展中的作用。

4 小結(jié)與展望

Lgr5廣泛分布于多種人體組織，在多種腫瘤中表達增加，提示它有著重要的生物學(xué)功能和臨床應(yīng)用前景。目前，關(guān)于Lgr5在不同信號途徑中發(fā)揮作用的機制以及Lgr5細胞是否代表了腫瘤干細胞等問題，還有待進一步的研究來證實。因Lgr5在腫瘤發(fā)生中的作用，有望成為腫瘤治療的新靶點。對Lgr5的研究提升了對干細胞生物學(xué)的理解，對鑒定和分離成體干細胞群、開發(fā)其臨床藥用潛能也有著很大作用。隨著對干細胞研究的不斷深入，有望在未來能利用這些潛在的人類干細胞群為胃腸、皮膚等疾病的治療提供新的手段。

[1] McDonald T,Wang R,Bailey W,etal.Identification and cloning of an orphan G protein-coupled receptor of the glycoprotein hormone receptor subfamily[J].Biochem Biophys Res Commun,1998,247(2):266-270.

[2] Hsu SY,Liang SG,Hsueh AJ,etal.Characterization of two LGR genes homologous to gonadotropin and thyrotropin receptors with extracellular leucine-rich repeats and a G protein-coupled,seven-transmembrane region[J].Mol Endocrinol,1998,12(12):1830-1845.

[3] Carmon KS,Gong X,Lin Q,etal.R-spondins function as ligands of the orphan receptors LGR4 and LGR5 to regulate Wnt/beta-catenin signaling[J].Proc Natl Acad Sci U S A,2011,108(28):11452-11457.

[4] Maris JM,Hogarty MD,Bagatell R,etal.Neuroblastoma[J].Lancet,2007,369(9579):2106-2120.

[5] Gregorieff A,Clevers H.Wnt signaling in the intestinal epithelium:from endoderm to cancer[J].Genes Dev,2005,19(8):877-890.

[6] Barker N,Bartfeld S,Clevers H.Tissue-resident adult stem cell populations of rapidly self-renewing organs[J].Cell Stem Cell,2010,7(6):656-670.

[7] Barker N,Van Es JH,Jaks V,etal.Very long-term self-renewal of small intestine,colon,and hair follicles from cycling Lgr5+ve stem cells[J].Cold Spring Harb Symp Quant Biol,2008,73:351-356.

[8] Yui S,Nakamura T,Sato T,etal.Functional engraftment of colon epithelium expanded in vitro from a single adult Lgr5+stem cell[J].Nat Med,2012,18(4):618-623.

[9] Barker N,van Es JH,Kuipers J,etal.Identification of stem cells in small intestine and colon by marker gene Lgr5[J].Nature,2007,449(7165):1003-1007.

[10] Snippert HJ,van der Flier LG,Sato T,etal.Intestinal crypt homeostasis results from neutral competition between symmetrically dividing Lgr5 stem cells[J].Cell,2010,143 (1):134-144.

[11] Sato T,van Es JH,Snippert HJ,etal.Paneth cells constitute the niche for Lgr5 stem cells in intestinal crypts[J].Nature,2011,469(7330):415-418.

[12] O′Brien CA,Pollett A,Gallinger S,etal.A human colon cancer cell capable of initiating tumour growth in immunodeficient mice[J].Nature,2007,445(7123):106-110.

[13] Merlos-Suárez A,Barriga FM,Jung P,etal.The intestinal stem cell signature identifies colorectal cancer stem cells and predicts disease relapse[J].Cell Stem Cell,2011,8(5):511-524.

[14] Fuchs E.The tortoise and the hair:slow-cycling cells in the stem cell race[J].Cell,2009,137(5):811-819.

[15] Vander Flier LG,Sabates-Bellver J,Oving I,etal.The intestinal Wnt/TCF signature[J].Gastroenterology,2007,132(2):628-632.

[16] Ginestier C,Hur MH,Charafe-Jauffret E,etal.ALDH1 is a marker of normal and malignant human mammnary stem cells and a predictor of poor clinical outcome[J].Cell Stem Cell,2007,1(5):555-567.

[17] Sleeman KE,Kendrick H,Robertson D,etal.Dissociation of estrogen receptor expression and in vivo stem cell activity in the mammary gland[J].J Cell Biol,2007,176(1):19-26.

[18] Becker L,Huang Q,Mashimo H.Immunostaining of Lgr5,an intestinal stem cell marker,in normal and premali gnant human gastrointestinal tissue[J].ScientificWorld Journal,2008,8:1168-1176.

[19] Yamamoto Y,Sakamoto M,Fujii G,etal.Overexpression of orphan G-protein-coupled receptor,Gpr49,in human hepatocellular carcinomas with beta-catenin mutations[J].Hepatology,2003,37(3):528-533.

[20] Tanese K,Fukuma M,Yamada T,etal.G-protein-coupled receptor GPR49 is up-regulated in basal cell carcinoma and promotes cell pmliferation and tumor formation[J].Am J Pathoi,2008,173(3):835-843.

[21] Nakata S,Campos B,Bageritz J,etal.LGR5 is a Marker of poor prognosis in glioblastoma and is required for survival of brain cancer stem-like cells[J].Brain Pathol,2013,23(1):60-72.

[22] Swetlana R,Taubert H,Bache M,etal.A novel splice variant of the stem cell marker LGR5/GPR49 is correlated with the risk of tumor-related death in soft-tissue sarcoma patients[J].BMC Cancer,2011,11:429.