哮喘的遺傳學研究進展

孫金霞(綜述)，崔玉寶(審校)

(鹽城衛生職業技術學院醫學檢驗教研室，江蘇 鹽城 224005)

哮喘是一種嚴重的過敏性疾病，是最常見慢性病之一。它的特點是氣管支氣管對多重刺激的反應性增加，各種炎性細胞特別是嗜酸性粒細胞浸潤增加，呼吸道上皮細胞損傷、呼吸道平滑肌肥厚，且血清總IgE升高。哮喘往往在夜間加劇，可進展為嚴重的氣流阻塞、呼吸急促、呼吸困難和吸氧不足。在少數情況下，會引發如缺氧癲癇發作，呼吸衰竭，甚至死亡等嚴重后果。流行病學研究表明，全世界范圍內呼吸道過敏的患病率高達15%～30%[1]，哮喘影響了3.5%～20%的人群[2]。目前全球有300萬哮喘患者，且患者數以每10年50%的速度增長，據世界衛生組織估計到2020年，哮喘伴隨慢性阻塞性肺疾病將成為人類第三大死亡原因[3]。哮喘的發病既有遺傳因素，也有環境風險因素的作用。目前已經發現人類多個染色體上存在與哮喘相關的易患基因，對這些易患基因的確定有助于哮喘的防治。

1 哮喘遺傳學研究方法

對遺傳病遺傳基礎的研究主要依賴于兩種方法：全基因組連鎖分析和候選基因關聯研究。全基因組連鎖分析的對象是有受累遺傳病患者的家族。按染色體上均勻分布的遺傳標記對家庭成員進行基因分型。當遺傳病患者等位基因數目高于預期值時，就要對這些遺傳區域進行分析。一旦發現這樣的區域，往往涉及DNA的2～3 Mbp，包含數百個基因，表明這個基因組區域內有疾病易患等位基因，即認為該區域與遺傳病間具有連鎖關系。該區域在后期進一步進行遺傳變異位點的深度掃描，直至疾病相關基因確定為止。

連鎖分析研究法能夠發現新基因和新途徑，不需要任何先驗假設，且分辨率很高。此外，連鎖分析是識別有明顯表型效應的等位基因的理想方法，因為這樣的等位基因在較小的人群樣本中也能發現連鎖信號，往往多數研究很難得到大量的人群樣本[4]。通過在不同群體中發現連鎖作用能進一步驗證連鎖分析的結果。但通常不同人群中發現的哮喘連鎖區域具有區域依賴性。隨著全基因組關聯研究的出現和應用，全基因組連鎖分析的應用在迅速衰退。候選基因關聯研究重點放在一些預計對疾病的發病機制有關聯一些基因。候選基因的變異及相關表型的關聯分析，通過對病例-對照研究進行等位基因或基因型頻率的比較來完成。一般認為，聯分析在檢測中等頻率的等位基因時比連鎖分析法更有優勢。關聯分析的另一個優點是，更容易收集大量沒有相關性的患者樣本，有助于增加數據的統計力。然而，在一個標記周圍區域是完全相同的遺傳特性的可能性要比家族性患者的可能小得多。因此，關聯分析比連鎖分析需要更高密度的遺傳標記。

病例-對照研究的一個主要問題是不同人群結構會導致與疾病無關的病例與對照組間等位基因頻率的差異。新統計方法的發展允許檢測和校正病例和對照組間的不平衡，基于家庭的連鎖分析在數據量上沒有優勢，而關聯分析具有邏輯優勢[4]。盡管如此，不管使用什么方法來推定疾病易患基因，這種基因具體的作用只能通過進一步的功能實驗，如對細胞采用化學或藥理學抑制劑后對功能進行分析，甚至用動物模型在體內或體外對基因功能進行驗證。

2 已發現的哮喘易患基因

目前已知的對哮喘或過敏性疾病有作用的易患基因，主要通過分析過敏性炎癥、哮喘或哮喘表型的主要通路上一些基因的變異，如單核苷酸多態性(single nucleotide polymorphism，SNPs)間的相關性來確定。與哮喘相關的表型通常包括呼吸性狀，如哮鳴音、支氣管高反應性、肺功能參數；免疫學特性，如總異性血清IgE水平，過敏；臨床性狀，如特應性皮炎和(或)濕疹及結膜炎。

討論哮喘及過敏性疾病的文章有很多，這里僅討論從功能和免疫學角度來看的一些較強的哮喘和過敏性疾病易患基因。哮喘易患基因可以分為四大類：固有免疫和免疫調節相關基因；2類輔助性T細胞(T-helper type 2 cell,Th2)分化與功能效應相關基因；上皮細胞及黏膜免疫相關基因；與肺功能、呼吸道重構功能相關的基因。另外，還有一些基因是通過定位克隆確定的。下面從這幾個方面進行闡述。

2.1固有免疫和免疫調節相關基因 第一組基因位于固有免疫檢測和免疫調節連接處，并參與觸發免疫反應。過敏性炎癥和IgE調節會在很大程度上受一些編碼模式識別受體和胞外受體基因的多態調節，如CD14，Toll樣受體(Toll-like receptor，TLR)2、TLR 4、TLR6和TLR10；胞內受體，如核苷酸結合的寡聚化結構域成分1、2。有趣的是，識別受體基因的變異不僅與哮喘等過敏癥相關，還與腸炎和心血管疾病[5-6]相關，凸顯了固有免疫在調節組織與微環境接口中發揮的重要作用。免疫調節細胞因子的變異，如白細胞介素(interlenkin,IL)10、轉化生長因子β1(transforming growth factor-β1,TGF-β1)，以及能介導IL-6的抑制作用樹突細胞的信號轉導及轉錄激活因子3(signal transducer and activator of transcription 3，STAT3)，也會影響過敏癥的易患性。固有免疫基因與不同人群哮喘性狀相關，表明不同環境會對不同外環境中固有免疫系統表面產生作用。人類白細胞抗原Ⅱ類分子(human leukocyte antigen Ⅱ，HLAⅡ)在抗原呈遞作用中發揮至關重要的作用，許多研究顯示HLA-DR，HLA-DQ和HLA-DP等位基因，與過敏原特異性IgE反應之間存在強關聯性[7]。

2.2Th2分化和效應子功能相關基因 第二組哮喘易患基因包括調節初始CD4+Th分化成Th2極化的效應表型的相關基因，而初始CD4+Th分化成Th2極化過程是過敏性炎癥和哮喘的一個關鍵過程。Th2完全極化需要通過GATA結合蛋白3(GATA-binding protein 3，GATA3)誘導IL-4-IL-4Rα轉導的信號傳輸及STAT6的介導。GATA3的活化是Th2的總開關，會被轉錄因子T-bet抑制，通過蛋白質-蛋白質相互作用，從而干擾GATA3與靶DNA結合。因此，GATA3、T盒轉錄因子21、IL-4、IL-4RA、STAT6及IL-12B的常見突變與哮喘等過敏性疾病以及與糖皮質激素療的反應相關。

IL-13是過敏性炎癥的中央效應細胞因子。IL-13介導動物模型在肺部由Th2介導的全部反應特征主要包括：呼吸道高反應性、炎性細胞浸潤、黏液分泌過多和呼吸道纖維化。此外，IL-13、IL-4是誘導人類IgE合成的獨有的兩個細胞因子。IL-13及其受體在哮喘和過敏性鼻炎等呼吸道癥狀的患者體內高表達[8-9]，IL-13在胚胎時期即表達，在新生兒時期即在T細胞作用下分泌，而這個時期是過敏性疾病易患性的關鍵時期。IL-13+2044GA(IL-13 Arg130Gln，rs20541)位于編碼區(Arg130Gln)，變異后的表達蛋白生物活性增加[10]，該多態性與哮喘、遺傳過敏性和異位性皮炎患者的血清總IgE的增加相關。IL-13-1112CT(rs1800925)是啟動子SNP，該多態與哮喘、特應性皮炎等過敏性疾病的易患風險增加相關，導致在極化的Th2中IL-13轉錄增加，絲裂原刺激的單核細胞中IL-13分泌增強[11]。值得注意的是，IL-13+2044GA和IL-13-1112CT高度連鎖不平衡。因此，攜帶兩個風險等位基因的個體預期會表達更多的高活性的IL-13異構體。

Th2的信號轉導通路的多態性不僅影響T細胞依賴性的IgE合成，也影響了依賴于嗜堿性粒細胞和肥大細胞的Th2因子表達IgE的擴增。高親和力IgE受體(FcεR1)的交聯是肥大細胞和嗜堿性粒細胞分泌Th2因子的主要刺激因素。正因為如此，多個研究對跨膜4域，亞家族A，成員2(MS4A2)-編碼FcεR1-鏈區域的SNP進行研究，都發現了哮喘易患位點[12]，這些區域可能影響肥大細胞的IgE依賴性炎性介質的釋放。過敏性炎性反應的效應階段依賴于嗜酸性粒細胞祖細胞中Th2來源的IL-5和IL-5RA之間的相互作用。IL-5驅動嗜酸性粒細胞招募呼吸道上皮細胞來源的趨化因子，進而成為Th2因子的一個重要來源。IL-5和IL-5RA上的SNP同樣也與哮喘性狀相關[13-14]，但作用不如Th2途徑中其他基因的多態性作用強烈。

2.3上皮細胞相關基因 第三組易患基因在上皮細胞中表達，存在于固有免疫和適應性免疫中間層。上皮細胞分泌趨化因子，如趨化因子CCL5(CC chemokine 5，CCL5)招募T細胞和嗜酸性粒細胞，趨化因子CCL11、CCL24和CCL26則是強大的嗜酸性粒細胞的誘餌。上皮細胞也分泌抗菌肽和子宮珠/克拉拉細胞16×103蛋白，通過作用于樹突狀細胞抑制Th2的分化。所有這些基因是穩定的哮喘和遺傳過敏性的候選基因。絲氨酸肽酶抑制因子Kazal型5(serine peptidase inhibitor Kazal type 5，SPINK5)的表達僅限于上皮細胞，保護細胞免受肥大細胞或過敏原釋放的蛋白酶的蛋白酶降解作用。在SPINK5的突變會導致瑟頓綜合征，表現為濕疹樣的上皮細胞的功能缺陷。此外，rs2303067(SPINK5 Glu420Lys)與哮喘和濕疹有強烈相關性[15]。

聚角蛋白微絲蛋白基因(filaggrin，FLG)是一種對上皮屏障的完整性至關重要的基因，是染色體1q21上表皮分化復合物的一員。FLG在表皮和口腔及鼻腔黏膜細胞中表達，但不在支氣管黏膜表達。在無過敏性皮炎的哮喘患者人群中，未發現哮喘和FLG突變的相關性。綜合研究表明，特應性皮炎患者在表皮屏障破裂后才導致哮喘的發生。最近的一項Meta分析發現，FLG變異對特應性皮炎的風險超過目前研究的任何其他候選基因[16]。然而，突變誘發特應性皮炎是極為罕見的。FLG基因突變往往導致尋常型魚鱗病，這是一種常見的隱性孟德爾遺傳性疾病，皮膚呈角質化，魚鱗病的患者高發特應性皮炎，FLG基因往往缺失或為雜合子[17]。所有這些研究結果表明，完整的上皮屏障系統在保護細胞免受環境因素的損害和復雜性基因疾病的發生中發揮十分重要的作用。

2.4肺功能相關基因 這一組易患基因主要由肺功能、呼吸道重構、疾病嚴重程度相關的一組基因組成，如腎上腺素受體2、腫瘤壞死因子是最為有力的哮喘易患基因。其他基因包括TGF-β1、白細胞三烯C4、肌鈣蛋白C等，這些基因影響了患者的治療，藥物基因組學對這些基因進行系統研究目的是確定藥理反應模式的基因變異[18]。

2.5通過定位克隆確定的相關基因 另外一類是通過連鎖分析確定后，再對該基因進行定位克隆確定的哮喘易患基因。第一個定位克隆獲得的哮喘基因是整合素金屬蛋白酶33(a disintegrin and metalloproteinase 33，ADAM33)[18]。①ADAM33基因，位于20號染色體的短臂末端。通過來自美國和英國的460例高加索患者的家庭進行連鎖分析，確定ADAM33是哮喘易患基因，其與哮喘和支氣管高反應性之間的有顯著聯系。ADAM33與哮喘及肺功能間的相關性在不同種族的多個人群中得到驗證[19]。②植物同源結構域指蛋白11(plant homeodomain finger protein 11，PHF11)位于染色體13q14區域，與過敏和血清總IgE水平同步連鎖。PHF11基因的SNP圖譜上確定有與IgE水平相關的數量性狀基因座。這些變異與臨床重哮喘相關。③二肽基肽酶10(dipeptidyl-peptidase 10，DPP10)位于第2號染色體上，對其周圍區域及高密度SNP及連鎖不平衡分析表明，哮喘的相關性位點在DPP10基因的起始外顯子上，DPP10基因編碼二肽基肽酶的同源物，參與細胞因子和炎癥趨化因子的外端的酶切作用[20]。④G蛋白偶聯受體基因位于第7號染色體短臂。對健康和哮喘患者進行支氣管活檢，編碼G蛋白偶聯受體的蛋白異構體表現出明顯的分布差異。芬蘭、加拿大的三組人群研究發現，標簽SNP單倍型與高血清IgE水平或哮喘相關[21]。⑤HLA-G，HLA-Ib基因位于染色體6p21區域，于2005年通過連鎖分析確定。該基因主要表在胚胎細胞的母胎界面表達，而母胎界面參與免疫抑制，對胎兒的母源耐受細胞有關。兩例哮喘患者支氣管上皮細胞中檢測到的可溶性HLA-G的表達，但正常個體中不表達，表明哮喘肺細胞中該基因表達上調[22]。⑥脆性X智力遲鈍蛋白作用蛋白2(cytoplasmic fragile X mental retardation protein interacting protein 2，CYFIP2)位于染色體5q33區域，突變篩查和關聯性分析顯示，CYFIP2的6個多態性位點與哮喘的發生、發展相關，疾病相關的純合子單倍型個體中CYFIP2表達明顯增加[23]。⑦IL-1受體相關激酶-M(IL-1 receptor-associated kinase M，IRAKM)是TLR和IL-1R信號通路中的負調控因子，位于12q13～24，肺活檢的免疫組織化學結果顯示上皮細胞中IRAKM高表達，表明固有免疫系統的過度活化與慢性呼吸道炎癥之間存在某種聯系[24]。⑧3q21區域的異位性皮炎易患區域[25]，該區域僅有一個基因，即編碼表皮膠原蛋白的基因COL29A1，這種蛋白在皮膚、肺和胃腸道高表達，這些部位往往與過敏性炎癥息息相關。

3 結 語

雖然目前對于哮喘的遺傳學機制已有大量研究，但哮喘遺傳學仍然存在很多問題。在《自然遺傳學》雜志的一篇報道表示，關聯研究的結果很難重復[26]。同樣，《胸腔》一篇評論文章認為多基因病的遺傳關聯研究由于設計粗糙和結果不可重復性獲得廣泛差評[27]。此外，即使對哮喘有影響的并且可重復的一些基因，在大量樣本研究時與哮喘僅有微小相關性，只能解釋極少的表型變異。為什么會出現如此大的爭議和復雜性？目前普遍認為是由實驗設計、樣本量不同加上分析缺陷導致的。然而，存在于復雜疾病下的生物學因素和過程的作用不應忽視，如復雜性疾病的表型異質性，基因與環境間的相互作用，基因之間的相互作用都是復雜性的來源。

哮喘是環境和遺傳因素共同參與的一種復雜的多基因疾病，在全世界范圍內造成了巨大的經濟和社會負擔。現研究發現超過100個位點與哮喘有關，面對大量的易患基因信息，接下來需要做的是通過大量的基因組數據開發哮喘更優的研究手段，來進行圖譜定位確定特定的基因以及表型特異的SNP位點，來澄清哮喘的發病機制，從而利用藥物基因組開發個體化治療藥物。因此，不同學科人員間，包括病理生理學、流行病學，臨床一線和遺傳學的相關研究人員應該保持更多的交流互動，從而將哮喘相關研究不斷推進。相信隨著基因技術的不斷更新及對哮喘相關基因研究的不斷深入，哮喘患者的基因治療即將成為現實。

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