惡性間皮瘤的分子生物學研究進展

姚銀麗 徐偉珍 毛偉敏

惡性間皮瘤(malignant mesothelioma，MM)是一種高侵襲性的腫瘤，預后極差。石棉暴露是目前認為與間皮瘤發生、發展較為密切的致病因素。由于20世紀50～70年代石棉材料的廣泛應用，我國間皮瘤的發生率有上升趨勢，為(0.1～0.6)/10萬，由于我國的人口基數龐大，總的發病人數多于其他國家。目前治療惡性間皮瘤的療效不佳，大部分患者發現時已無手術機會。腫瘤的快速進展以及目前尚無明確有效的治療方案使得MM患者的中位生存期只有12個月。雖然距離MM首次報道已經過去50多年，但目前仍沒有建立起最優治療策略，對MM的診斷、分期以及治療仍然困難重重。近幾年來，對惡性間皮瘤的分子生物學研究逐漸成為熱點。檢測MM發生、發展過程中基因表達改變，抑癌基因和癌基因的變異，以及研究高危人群致癌過程的有效標志物，將對MM的診斷、治療及預后具有重要的意義。本文就惡性間皮瘤流行病學特征、潛在分子靶點的發現及研究進展做一綜述。

一、惡性間皮瘤的流行病學特征

惡性間皮瘤是一種來源于間皮細胞的原發腫瘤，它可發生在胸膜、心包膜、腹膜和卵巢上皮細胞，其中惡性胸膜間皮瘤(malignant pleural mesothelioma，MPM)發生率約占間皮瘤的70%[1]。在組織病理學上分為上皮型、肉瘤型、混合型(雙向型)3大類，預后均極差。石棉暴露是目前認為與間皮瘤發生、發展較為密切的致病因素。自從1960年，Wagner首次報道石棉接觸與MM的相關性后，陸續有研究證實世界上石棉采礦工人MM高發，有石棉暴露史的人群中MM的發生率可達到100/(百萬·年)，而正常人群中MM的發生率只有1/(百萬·年)，且由于職業因素，男性MM的發生率遠高于女性。石棉已被國際癌癥研究中心(IARC)確認為致癌物。石棉纖維暴露可誘發間皮細胞內DNA損傷及染色體異常[3]。間皮細胞能吞噬石棉纖維，石棉纖維與染色體或紡錘體纏繞，干擾有絲分裂過程，導致染色體結構異常和間皮細胞內非整倍體的形成。石棉纖維能吸收各種蛋白質和化學物質于表面，導致有害物質的積累，其中包括致癌物。石棉纖維還結合重要的細胞蛋白，對于正常間皮細胞，這些蛋白的缺失可能是有害的。體內研究發現，石棉纖維暴露后引發由大量單核-吞噬細胞組成的炎性反應，巨噬細胞吞噬纖維，但不能將其消化，并釋放各種細胞因子和生長因子，從而誘導炎癥和腫瘤的產生[4]。

最近研究發現，腫瘤壞死因子α及NF-κB通路在石棉致間皮瘤發生、發展過程中起了關鍵作用[5]。接觸石棉到MM的確診有40年的潛伏期[6]。因此，在該潛伏期內，防止石棉采礦工人再次接觸石棉，在很大程度上可能降低其發生率及病死率。雖然許多發達國家及一些發展中國家已禁止石棉的生產及銷售，但由于潛伏期的影響，近幾年MM的發生率及病死率仍呈不斷上升趨勢。作為世界上最大的石棉消費國，不久的將來，中國可能會遭遇MM的發病高峰。盡管關于石棉如何致MM發生的可能機制已被探討，但準確的發病機制仍需要進一步探索。除石棉暴露以外，目前還發現放射線照射、接觸其他礦產纖維如毛沸石、感染SV40病毒以及遺傳易感性也是MM發生、發展的可能原因。

二、惡性間皮瘤診斷與治療的潛在分子靶點研究進展

惡性間皮瘤在臨床表現上無特異性，易誤診，大多數MM患者在確診時已是晚期，失去手術切除機會，故預后極差。目前對MM沒有明確有效的治療方法，放療受限于腫瘤體積大，很難達到根治量。作為一線化療方案，培美曲塞與順鉑的聯合治療提高了部分患者的存活率，但遠期生存率仍較差。因此，尋找惡性間皮瘤診斷與治療的潛在分子靶點具有重要意義。

基于分子生物技術的不斷發展，對間皮細胞惡性轉化中分子事件的研究逐漸增多。人們通過細胞遺傳學分析染色體核型、比較基因組雜交技術和單核苷酸多態性分析等方法發現，惡性間皮瘤中存在雜合子的缺失，且檢測到染色體臂的 1p-、3p-、4p-、4q-、6q-、9p-、13q-、14q-、15q-和 22q-這些區域發生頻繁缺失[7]。MM細胞系與人腫瘤組織存在共同的染色體突變區域。然而一些研究者發現，由于人腫瘤組織中存在少量的正常組織，結果顯示MM細胞系在這些染色體區域突變的頻率要高于人腫瘤組織。此外，研究還發現在這些區域存在著較重要的腫瘤抑制基因，他們包括在染色體17p13上的p53基因、9p21上的p16INK4a/p14ARF基因和位于22q12的神經纖維瘤病Ⅱ型(neurofibromatosis type 2，NF2)基因。這些抑癌基因的失活，可能在MM的發生和發展中發揮著重要作用。

1.p53與間皮瘤:p53基因是一種抑癌基因，定位于人類染色體17p13.1，主要通過抑制細胞的增殖及促進細胞凋亡來穩定基因組、抑制突變細胞的產生。p53基因突變可促進細胞進入持續的分裂狀態，抑制細胞凋亡，導致腫瘤的產生。在人類惡性腫瘤中普遍存在p53基因的突變，而在MM中，只有20%的患者發生該基因突變，突變率較其他惡性腫瘤明顯偏低[8]。但進一步研究發現，其他途徑也可導致p53基因的表達異常。

通過熒光原位雜交(FISH)分析發現，50%～70%的惡性間皮瘤及培養的MM細胞系中存在純合子p16INK4a/p14ARF的缺失，影響兩條抑癌通路p53和成視網膜細胞瘤蛋白(retinoblastoma protein，pRb)的失活導致惡性胸膜間皮瘤的發生，并提示預后不良[9]。INK4a/ARF基因定位于人類染色體 9p21，是重要的細胞周期調控基因，其表達產物p16INK4a和p14ARF蛋白分別在pRb和p53通路中發揮重要調節作用。p16INK4a是細胞周期蛋白依賴性激酶(cyclin-dependent protein kinases，CDK)的抑制劑，通過失活CDK4/CDK6抑制蛋白質pRB的磷酸化，減少轉錄因子 E2F的釋放，將細胞阻滯于 G1期。而p14ARF是在細胞DNA損傷后通過加速泛素蛋白連接酶(murine double minute 2，MDM2)的降解，導致抑癌基因p53水平升高，抑制細胞異常分裂，并促進細胞凋亡。最近的動物實驗發現，鼠 p16INK4a/p19ARF，與人p14ARF同源，缺失其中一個基因會對石棉誘導的MM易感，若兩個基因都缺失，則會加速石棉對腫瘤的誘導作用[10]。p16INK4a/p14ARF基因可以用來預測惡性間皮瘤的發生。

2.PTEN與間皮瘤:磷酸酶-張力蛋白同源物基因(phosphatase and tensin homolog deleted on chromosome ten，PTEN)定位于染色體 10q23，基因全長200kb，編碼5.5kb的mRNA。研究發現，PTEN基因在人染色體10q23頻繁缺失，與腫瘤的發生密切相關。約50%～80%的單等位基因突變存在于散發性腫瘤，30%～50%發生在乳腺癌、結腸癌和肺癌，而在子宮內膜癌及成膠質細胞瘤中純合性缺失更常見，且與較差的預后和轉移有關[11]。目前有關PTEN與惡性間皮瘤的報道較少，且存在一定的爭議。

Agarwal等[12]的一項研究收集86例MM標本，結果顯示只有26.7%的標本PETN基因表達缺失，而超過26.7%的標本顯示PTEN基因低表達。第2項研究用21株MM細胞株進行篩選，發現只有2株細胞株PTEN基因表達缺失，而與正常間皮細胞株MET5a相比，7株細胞顯示PETN基因低表達。另一方面，Opitz等[13]納入341例MM患者進行研究，其中發現62%的患者PTEN表達缺失，并提示較差的存活率。因此，在惡性間皮瘤中PTEN基因表達缺失或低表達，仍需大量研究確認。

PI3K/AKT抑制劑:PTEN基因還是人類發現的第1個具有磷酸化酶功能的抑癌基因。PTEN通過使PIP3脫磷酸化為PIP2，而成為PI3K/AKT信號轉導通路的主要負調控因子。PTEN表達的下降，將導致PIP3的過表達，進而活化AKT和3'磷酸肌醇依賴的激酶 1(3'-phosphoinositide-dependent kinasel，PDK1)，PDK1是一個63kDa的絲氨酸/蘇氨酸(Ser/Thr)蛋白酶，它是AKT的上游活化激酶。PDK1可在磷酸化AKT的Thr308位點使AKT的活性增加30倍以上，促進細胞異常增殖。因此，通過藥物抑制PI3K/AKT信號通路，可抑制腫瘤的生長。然而1993年研發的PI3K/AKT抑制劑LY294002被報道特異性差，毒性不良反應大。此后，新的PI3K/AKT抑制劑不斷被研發。目前，新藥哌立福在Ⅲ期臨床試驗中被用于治療多發性骨髓瘤和大腸癌[14]。臨床上也嘗試用PI3K/AKT抑制劑來治療惡性間皮瘤，但缺少大規模的臨床試驗。

在核內，PTEN能調節Rad51的表達，減少自發性DNA雙鏈斷裂，從而維持染色體的完整性[15]。PTEN還能與p53結合成復合體，在DNA損傷時，保持p53的高乙酰化狀態，調節p53的穩定性及活性。而研究發現，這種機制與上述所講的磷酸化過程完全獨立[16]。此外，AKT通過在Ser166和Ser186位點磷酸化MDM2，使其進入細胞核內，從而導致p53的恒定失活。因此，利用PTEN基因負向調控PI3K/AKT信號轉導通路，能夠提高p53的表達及其轉錄活性，提高腫瘤細胞對化療的敏感度[17]。盡管我們已知曉PTEN在多種癌癥中起關鍵作用，但是PTEN在MM中的作用還需進一步探索。

3.NF2基因與間皮瘤:NF2基因是一種腫瘤抑制基因，編碼一個含有FERM區域的蛋白merlin，該蛋白與細胞的活動與增殖密切相關。NF2基因定位于22q12.2，由17個外顯子組成。而細胞遺傳學資料表明，間皮瘤細胞系中第22號染色體的數目和結構改變十分頻繁。相關研究證實，40%～50%的間皮瘤患者發生了NF2的突變。由于NF2基因突變，導致其編碼的蛋白質變性，從而喪失了腫瘤抑制作用[9]。

NF2編碼的蛋白merlin與4.1超蛋白家族中保守的埃茲蛋白(ezrin)、根蛋白(moesin)、膜突蛋白(moesin)ERM家族具有高度同源性，EMR蛋白含有一個保守的氨基末端，稱FERM區，連接著一個α螺旋臂以及一個帶電荷的羧基末端區域。ERM蛋白的FERM區域與羧基尾端相互作用導致蛋白質形成一種閉合式的構象，幾個蛋白結合部位被隱藏，導致ERM處于休眠狀態。但不同的是merlin的羧基端缺少1個保守的F-肌動蛋白的結合位點，當merlin分子內N端和羧基端締合時，雖處于閉合狀態，但仍具有活性。若merlin的羧基端被磷酸化，抑制分子內結合，導致蛋白質具有開放狀態但不具備功能上的活性。Li等[18]使用惡性間皮瘤細胞系和Met-5A永生型細胞系進行實驗研究發現merlin蛋白的腫瘤抑制活性是由E3泛素化鏈接酶CRL4 DCAF1介導的。當merlin處于活化閉合狀態，能聚集在細胞核內，并且能與DCAF1結合，抑制E3泛素化鏈接酶CRL4 DCAF1的生物活性，使細胞周期停止，抑制腫瘤的發生。而基質的黏附和整合素受體酪氨酸激酶信號轉導的后續活化能激活絲氨酸-蘇氨酸激酶PAK，使merlin的羧基端磷酸化，導致merlin失活，無法進入核內，不能抑制 CRL4 DCAF1的生物活性。CRL4 DCAF1能促進廣泛的致癌基因的表達，如泛素轉錄因子，組蛋白，染色質重塑酶等，導致腫瘤的產生。而Marrow等[19]發現merlin失活不僅僅是基突變導致的，其他機制也能使merlin失活。McClatchey等發現Merlin通過對細胞表面多種受體的調控來抑制信號轉導，而一旦Merlin失活，就會激活多種促有絲分裂的信號通道，導致細胞異常增殖。其中研究較多的是PI3K-AKT-mTOR通路。哺乳動物西羅莫司靶蛋白(mammalian target of rapamycin，mTOR)是一種非典型的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，被認為是一種雷帕霉素的細胞內靶點。細胞外信號分子作用于受體酪氨酸激酶，激活K-ras和磷脂酰肌醇-3激酶(phosphatidylinositol-3 kinase，PI3K)，后者可使蛋白激酶B(protein kinase B，AKT)激活，而活化的AKT可直接激活mTOR，也可通過下游信號作用于mTOR。該通路不僅在蛋白合成與細胞增殖中起重要調節作用，與腫瘤的侵襲轉移也密切相關。研究顯示，同時有PI3K和mTOR信號通路激活的MM患者預示更差的存活率。Lopez-Lago等研究發現merlin失活，能激活mTOR通路，促進MM細胞異常增殖。并且，在Merlin突變的MM細胞中發現，mTOR抑制劑雷帕霉素能選擇性地抑制該細胞的生長。因此，mTOR蛋白可作為惡性間皮瘤潛在的治療靶點。

Suzuki等在對21株MM細胞系進行實驗時，發現其中13株細胞AKT活性增高，表明惡性間皮瘤發展過程中存在PI3K-AKT-mTOR通路的激活。通過對MPM組織和細胞系研究證實，磷酸化-mTOR的表達和NF2的表達存在反比關系。臨床上利用NF2和磷酸化mTOR進行免疫組化來篩選對mTOR抑制劑敏感的MPM患者成為可能。已有研究者根據這些臨床前研究，用mTOR抑制劑雷帕霉素來治療MPM患者。此外，Brevet等研究發現，單獨抑制mTOR信號通路可能不足以抑制腫瘤的生長，在MPM細胞系中，由于mTOR信號通路的抑制激活了并行c-MET，表皮生長因子受體(epithelial growth factor receptor，EGFR)和胰島素樣生長因子1受體(insulin-like growth factor 1 receptor，IGF1R)信號通路，可能進一步激活AKT。隨后Carracedo等研究發現，單獨抑制mTOR信號通路減輕了PI3K的反饋抑制，從而允許恢復PI3K的下游AKT信號激活。為了解決mTOR反饋激活AKT這一問題，雙PI3K/mTOR抑制劑已被廣泛應用于臨床。

三、展 望

大量研究表明，石棉暴露與惡性間皮瘤的發生、發展密切相關，惡性間皮瘤的診斷可直接歸屬于職業的石棉暴露。西方國家已經禁止石棉的生產及銷售，而我國大部分地區仍在繼續使用。隨著惡性間皮瘤發生率的不斷上升，對其建立強制的預防、診斷及治療措施是必不可少的。同時，隨著對MM細胞遺傳學及表觀遺傳學的研究發現，許多抑癌基因的突變、缺失會直接影響惡性間皮瘤的發生、發展，在其診斷、治療及預后中具有潛在的生物標志物作用。雖然近年來對惡性間皮瘤分子生物學特別是某些抑癌基因及其蛋白功能的研究取得重大的進展，但仍存在許多疑問，如惡性間皮瘤的發病機制尚未完全闡述;間皮瘤的潛伏期很長，它的轉化過程中是否涉及多個基因的協同作用。此外，NF2基因的失活及PTEN基因表達的下調都能活化AKT基因，可見各信號通路互相交織成網，增加了對惡性間皮瘤研究的復雜性，因而有必要對參與惡性間皮瘤發生、發展的信號通路進行更加深入全面的研究，為惡性間皮瘤的個體化靶向治療提供更多的理論依據。

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