百草枯對肺組織細胞凋亡的影響

白 雪，盛英杰(綜述)，戢新平(審校)

(中國醫科大學附屬盛京醫院 1急診科， 2第二呼吸內科,沈陽 110004)

百草枯(Paraquat，PQ)又名對草快，其20%的溶液稱克無蹤，化學名為1，1′-二甲基-4，4′-聯吡啶陽離子鹽，分子式C12H14N2Cl2，是一種有機雜環類觸殺、滅生型高毒性除草劑。百草枯接觸土壤后迅速失活，對環境無污染，其應用于農業生產已有100多年的歷史。人類誤服百草枯后，無特效解毒劑，中毒死亡率極高，其主要臨床癥狀早期為多臟器功能衰竭，后期不可逆性肺纖維化。

百草枯具有與二胺、多胺及二胺二硫胱胺類似的結構，因而可與胺類物質競爭細胞膜上能量依賴性多胺攝取受體，進而被細胞攝取。這種轉運系統主要存在于肺泡Ⅰ、Ⅱ型上皮細胞及Clara細胞中[1-2]，巨噬細胞、內皮細胞及核間質細胞無此系統[3]。百草枯的選擇性聚集導致肺內濃度是血液濃度的10～90倍[4]。

1 百草枯對肺泡上皮細胞和肺血管內皮細胞的影響

研究發現，百草枯最先損傷肺泡Ⅰ型上皮細胞，后導致肺泡Ⅱ型上皮細胞水腫變性、肺毛細血管內皮細胞損傷，血管通透性增加[5]。Chen等[6]研究發現,百草枯可誘導大鼠肺泡上皮細胞凋亡，而姜文等[7]發現百草枯可誘導大鼠肺微血管內皮細胞凋亡，提示細胞凋亡參與百草枯誘導的急性肺損傷。

百草枯誘導肺泡上皮細胞和肺血管內皮細胞凋亡可能與下列因素有關：①氧化損傷。百草枯二價陽離子(PQ2+)+還原性輔酶Ⅱ→PQ++輔酶Ⅱ，PQ+進入細胞內，PQ++分子氧→PQ2++超氧陰離子(O2-)，O2-在超氧化物歧化酶的作用下，形成過氧化氫(H2O2)，H2O2在Fe2+催化的Fenton型Haber-Weiss反應中形成毒性更強的自由基，如羥自由基(OH-)[8],上述反應產生的氧自由基(如O2-、H2O2、OH-等)誘導細胞凋亡的發生。②鈣穩態失衡。曹鈺等[9]向小鼠腹腔內注射百草枯，觀察不同時間點肺組織細胞內鈣離子濃度變化及肺損傷程度，結果發現與陰性組相比，肺組織細胞胞質內鈣離子的濃度顯著升高，以第2～4日明顯。百草枯中毒時，可出現細胞內及線粒體內鈣超載，隨后發生的一系列凋亡改變，參與了肺組織細胞凋亡機制的形成[10]。③線粒體損傷。線粒體是細胞的“發電廠”，它參與了三羧酸循環和呼吸鏈的傳遞。線粒體結構和功能的穩定是細胞維持正常生理功能的前提，線粒體內、外膜之間的通透性轉換孔(permeability transition pore,PTP)具有調節線粒體膜通透性的作用。PTP屬于Ca2+依賴性電壓感受器，正常情況下，絕大多數PTP處于關閉狀態。Costantini等[11]發現，百草枯可使PTP電壓感受器上的二硫基化合物氧化，誘導PTP大量開放，同時百草枯誘導細胞內Ca2+超載，線粒體膜電位下降，PTP進一步開放，線粒體通透性增大，從而誘導細胞凋亡發生。

1.1死亡受體活化途徑 孔慶福等[12]、胡軍利等[13]研究發現，百草枯中毒大鼠肺泡巨噬細胞早期產生大量腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)，TNF-α通過與細胞膜上的腫瘤壞死因子受體(tumor necrosis factor receptor,TNFR)結合，一方面活化胞內凋亡相關蛋白，激活下游反應，觸發細胞凋亡；另一方面激活核因子κB(nuclear factor-kappa B,NF-κB),NF-κB是一類具有多向性轉錄調控作用的蛋白因子，正常情況下NF-κB位于細胞胞質內，與核轉錄因子抑制蛋白(inhibitors of kappa B，IκB)結合，使NF-κB處于無活性狀態。當細胞因子(如TNF-α)、氧自由基刺激后，NF-κB與IκB解離，NF-κB進入細胞核，啟動下游靶蛋白(包括TNF-α、白細胞介素6、白細胞介素8等)合成，TNF-α合成后反過來進一步激活NF-κB，從而形成惡性循環，導致組織細胞嚴重損傷[14-15]。

1.2線粒體途徑 Takeyama等[16]將表達野生型p53的人肺上皮樣細胞系L132與缺乏p53基因的人早幼粒細胞性白血病細胞系U937分別暴露于低濃度的百草枯培養液中培養，發現L132細胞系中p53大量表達，處于S期的細胞百分比明顯減少，說明細胞由G1期進入S期受阻；單細胞凝膠電泳顯示單鏈DNA斷裂；U937細胞系中DNA雖然受損，但處于S期的細胞百分比幾乎無明顯變化，顯示出對百草枯的抵抗力。該實驗說明百草枯可能通過p53蛋白的積累誘導細胞凋亡。Dinis-Oliveira等[17]研究表明，百草枯通過激活多條通路誘導肺組織的細胞凋亡，其中p53、轉錄激活蛋白呈時間依賴性表達，參與細胞凋亡調控。Yang等[18]將多巴胺能SY5Y細胞經百草枯處理48 h后，測定p53的表達及線粒體內凋亡途徑標志物發現，百草枯通過p53參與線粒體內途徑誘導人神經母細胞瘤SY5Y細胞凋亡。

Bcl-2蛋白家族成員與細胞凋亡關系密切，包括抗凋亡Bcl-2亞族和促凋亡Bax亞族、BH3亞族等。細胞是否發生凋亡及其嚴重程度取決于Bcl-2/Bax比值的變化，馬玉騰等[19]研究發現，百草枯中毒大鼠肺組織中Bcl-2、Bax蛋白的表達均增高，但Bcl-2增高幅度低于Bax，導致Bcl-2/Bax比值下降，肺組織細胞凋亡增加。Fei等[20]研究發現，百草枯刺激Bcl-2同源拮抗劑(Bcl-2 homologous antagonist/killer，Bak)、BH3結構域凋亡誘導蛋白(BH3 interacting domain protein 3，Bid)、促凋亡調節蛋白BNIP3(Bcl2/adenovirus E1B 19kDa protein interacting protein 3)及Noxa蛋白呈高濃度表達，Bak、BNIP3及Noxa基因沉默可以保護細胞免受百草枯的毒性，該實驗證實Bcl-2蛋白家族成員參與百草枯誘導的細胞凋亡的發生。

百草枯可造成線粒體膜電位下降，PTP大量開放，導致細胞凋亡啟動因子(如細胞色素C、凋亡酶激活因子、細胞凋亡誘導因子)從線粒體內釋放，激活半胱氨酸蛋白酶家族中的胱天蛋白酶(caspase)9和caspase-3，caspase-3是細胞凋亡過程中的關鍵酶，caspase-3的激活可以看作是細胞凋亡的標志[21]。Caspase-3激活后誘導蛋白質水解，從而誘導細胞凋亡[17]。Rincheval等[22]還發現應用Bcl-2和caspase抑制劑并不能抑制百草枯誘導的細胞凋亡，推斷百草枯可能還通過其他途徑誘導細胞凋亡。張志堅等[23]通過對百草枯中毒大鼠腎組織中caspase-3表達的研究發現，百草枯染毒組中caspase-3蛋白的表達隨時間推移逐漸增多，推測百草枯中毒后腎臟損傷與細胞凋亡有一定的關系。González-Polo等[24]將小腦顆粒細胞置于低濃度百草枯中培養，結果發現線粒體上細胞色素C水平顯著減少，而水解蛋白酶和caspase-3活性增加，DNA裂解片段增加，細胞凋亡增強。

與此同時，Mohammadi-Bardbori等[25]發現百草枯的氧化還原反應還可以導致線粒體內膜上的脂質發生過氧化，間接引起細胞凋亡的發生。

1.3內質網應激途徑 死亡受體活化以及線粒體損傷途徑是細胞內兩條經典的凋亡途徑，而內質網應激啟動的細胞凋亡途徑是近10年來新發現的凋亡通路。內質網應激引起的細胞凋亡有其獨特的信號轉導通路，參與內質網應激的分子伴侶和感受蛋白具有特異性。

Chen等[6]研究發現，百草枯處理24 h后的大鼠肺泡上皮細胞系L2中，細胞生存能力顯著下降，內質網應激相關信號因子和蛋白(如糖調節蛋白78、生長停滯及DNA損傷基因)表達水平顯著增高，提示內質網應激途徑參與了百草枯誘導的肺組織細胞凋亡。該研究同樣證實百草枯提高了caspase-3及caspase-7的活性，促進了Bax、Bak、p53蛋白表達，抑制了Bcl-2的基因表達。

綜上所述，百草枯可通過死亡受體活化途徑、線粒體途徑、內質網應激途徑誘導肺組織細胞凋亡。

2 百草枯對多型核中性粒細胞的影響

百草枯對多型核中性粒細胞(polymorphonuclear neutrophils，PMN)是機體抵御外來病原體的第一道屏障，當發生輕微炎性反應時，外周血中的PMN黏附于血管壁并游出至炎癥部位，完成吞噬、殺菌作用后即發生凋亡，不引起組織細胞損傷。大量研究發現，當肺組織炎性因子大量釋放、Ca2+濃度升高時，PMN凋亡受到抑制，凋亡延遲，導致PMN處于持續激活狀態，從而釋放大量毒性物質，造成組織細胞損傷[26-27]。

劉建輝等[28]在大鼠腹腔注射百草枯，建立急性肺損傷動物模型，檢測肺泡灌洗液中PMN凋亡率，結果發現PMN的凋亡率顯著下降，染毒第3日凋亡率最低；應用NF-κB抑制劑(二硫代氨基甲酸吡咯烷)可促進PMN凋亡，推測百草枯通過多條通路誘導NF-κB激活，從而抑制PMN的凋亡，延長PMN的生存時間。除此之外，有學者還認為PMN的凋亡延遲可能與caspase-3和caspase-9的活性降低及線粒體膜電位持續降低有關[29]。

3 百草枯對肺泡巨噬細胞的影響

百草枯對肺泡巨噬細胞所產生的細胞毒性呈時間依賴性，百草枯中毒早期肺泡內大量炎性細胞聚集，以肺泡巨噬細胞為主。肺泡巨噬細胞合成并釋放大量細胞因子、前炎性介質、趨化因子以及蛋白水解酶毒性物質，造成急性肺損傷、間質水腫、肺泡內出血，而后肺泡巨噬細胞自身凋亡增加，吞噬能力下降，導致凋亡的中性粒細胞不能及時被清除，產生遲發性壞死，加重炎性反應的發生[30]。

4 小 結

大量研究顯示細胞凋亡參與了百草枯所致的急性肺損傷的發生過程，由于肺泡上皮細胞和肺微血管內皮細胞凋亡增加，一方面導致肺泡上皮細胞大量丟失，基膜受損，肺泡表面活性物質減少，肺泡塌陷，肺泡上皮表面的離子轉運系統遭到破壞，肺泡間隙水電解質紊亂，微血管通透性增高，引起肺水腫發生；另一方面，有學者認為正是由于肺泡上皮細胞和肺微血管內皮細胞缺失，導致肺間質成纖維細胞代償性增生，發生過度纖維增殖修復反應，從而造成不可逆的肺纖維化形成。同時，PMN聚集和凋亡延遲進一步加重了肺組織及細胞的損傷。

因此，靶向抑制肺泡上皮細胞及肺微血管內皮細胞凋亡以及促進PMN凋亡可能減輕急性肺損傷，甚至阻止肺纖維化的發生。

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