亞穩外延等位基因與結直腸癌變機制相關性研究進展

劉家麒，游柳平綜述 黃躍南審校

綜 述

亞穩外延等位基因與結直腸癌變機制相關性研究進展

劉家麒，游柳平綜述 黃躍南審校

亞穩外延等位基因；結直腸癌；無創檢查；DNA甲基化；表觀遺傳標志

亞穩外延等位基因(MEs)是哺乳動物表觀等位基因組位點，可以被一種可變、可逆的方式修飾，使遺傳上相同細胞出現不同的表型分布[1，2]。多項研究結果顯示，在胃癌、乳腺癌、大腸癌、腎母細胞瘤中一些MEs基因發生DNA甲基化，且與腫瘤的發生、發展密切相關[3～13]。結直腸癌(colorectal carcinoma，CRC)是最常見的惡性腫瘤，近年發病率和病死率明顯上升。大量證據表明，無創檢查可以明顯提高CRC的早期診斷率，已得到公眾的認可。迄今為止，DNA甲基化檢測是一種無創檢查CRC的理想方案。本文就MEs相關CRC癌變機制的最新進展綜述如下。

1 結直腸癌的早期檢測與預后

結直腸癌包括結腸癌和直腸癌，是世界范圍內癌癥相關疾病發病和死亡的一個主要原因。CRC在男性是第3位最常見的惡性腫瘤，在女性惡性腫瘤居第2位，2008年有超過120萬個新發病例，估計有608 700人死亡[14]。近幾十年來,隨著社會經濟的發展和生活水平的提高,在包括中國、日本、韓國和新加坡在內的一些亞洲國家和地區，CRC的發病率增加了2～4倍，患病率也呈現持續上升的趨勢，這與飲食習慣趨向于高蛋白質、高脂肪、低纖維素變化有很大關系。被診斷為CRC的患者往往存在遠處轉移(IV期)且無法治愈，大約40%的CRC患者死于腫瘤的轉移。顯然，局部癌癥(I/II期)及早發現更有利于根治性治療，提供更好的預后。

現有的CRC篩查技術包括大便隱血試驗、雙對比鋇灌腸、內窺鏡檢查、直腸指診以及血清癌胚抗原(CEA)的檢驗。現有的篩選方式使病死率僅有下降，但沒有達到很高的公眾參與。例如結腸鏡檢查是侵入性的策略，而大便隱血測試的用途有限，因為需要進行反復測量并受到膳食成分的干擾；在早期階段CEA缺乏足夠的靈敏度，容易受到憩室炎、胃炎、糖尿病等良性疾病的影響。在過去的10年，腫瘤來源的異常DNA可以在癌癥患者的血漿或血清中檢測發現，DNA甲基化(DNA methylation)用于早期癌癥的檢測是一個很有前途的工具。幾項研究證明來源于癌癥患者血液中實體腫瘤的自由DNA的存在[3～13]，提高了在被檢者體內檢測出癌癥特異性分子的可能性。生物標志物的使用，特別是表觀遺傳生物標志物血清、尿液、糞便，有望縮小侵襲而可靠的測試和非侵入性但不可靠研究之間的差距。無創檢查診斷CRC和癌前病變的DNA甲基化的生物標志物已被廣泛研究，無創更利于患者接受，同時提高CRC篩查率。

2 MEs的生物學功能

表觀等位基因(epiallele)是一種廣義生物等位基因，是在同一基因座位中，DNA發生不同程度的甲基化所形成的等位基因。由于環境對表觀遺傳標記的影響，有3個基因組目標可能對基因表達有易感性：一些管家基因的啟動子區域、與MEs鄰近的轉座子元件和印記基因的調控元件。表觀遺傳學改變，包括DNA甲基化和組蛋白修飾，可以獨立地影響基因表達的遺傳密碼。表觀基因在妊娠期、新生兒發育期、青春期和老年期都容易發生異常，但在胚胎發育過程中最容易受到環境因素的影響。因為在早期發育過程中DNA合成的速率很高，而且人體正常組織發育所需的復雜DNA甲基化的圖案和染色質結構也是這個時期建立的。MEs是Rakyan在2002年發現的哺乳動物基因組位點，這個位點可以被一種可變、可逆的方式修飾，使遺傳上相同細胞出現不同的表型分布[1，2]。等位基因的表達常常與轉座子的表觀狀態有關，大多數的轉座子元件是沉默的，但是轉座子元件子集的表觀遺傳狀態是亞穩的，并且以一個隨機地方式從低甲基化到高甲基化變化。在實驗室對鼠的研究發現產前環境可以影響產后表型，這為早期環境影響哺乳動物的表觀基因組的修飾并且關聯到不同疾病表型提供了根據[15，16]。環境表觀基因組學中MEs是已知的對環境敏感的表觀遺傳標記，這種可變的表觀遺傳狀態影響鄰居基因的表達。近年來研究發現DNA甲基化是發生癌變早期階段頻繁出現的表觀遺傳學變化，可以作為癌癥存在的一個指標[7，17]。此外，啟動子區域內異常的DNA甲基化基因可能會導致染色質基因的轉錄下調[18]。抑癌基因的啟動子CpG島甲基化是一種常見的人類癌癥的標志[19，20]，有助于癌癥的發生和發展。一般來說，腫瘤抑制基因的表達減少是由于等位基因的喪失或啟動子區域的超甲基化。一項前瞻性研究發現，一些DNA甲基化的基因的變化已被聯系到各種形式的人類疾病，如哮喘和急性髓系白血病、胃癌、乳腺癌、大腸癌、腎母細胞瘤等，這提示MEs在腫瘤潛在的致病作用，并強調MEs可能是這些惡性腫瘤的發展起源。其中與CRC關系最密切的基因有EBF3、KCNK15、TCERG1L、FBN2、NDRG4等[16，21，22]。

2.1 EBF3 早期B細胞因子(early B-cell factor，EBF)為核轉錄因子,又稱COE或O/E,家族成員由EBF1、EBF2、EBF3、EBF4組成，均通過其非典型的鋅指結構(H-X3-C-X2-C-X5-C)與含有5c-CCCNNGGG-3c的DNA序列結合，在神經系統發育、B細胞成熟、骨質代謝平衡、脂肪細胞分化成熟及腫瘤發生中發揮重要作用。EBF3在1997年由Wang等[23]利用序列同源性篩選的方法在鼠胚胎cDNA文庫中發現，人EBF3由551個氨基酸殘基組成，相對分子質量約為60 kD，mRNA全長為4361bp，基因定位于染色體10q26.3。EBF3 mRNA廣泛表達于心臟、胎盤、肝臟、骨骼肌等組織，在細胞生長、增殖、細胞凋亡中具有關鍵作用。EBF3作為一種抑癌基因，在不同的腫瘤細胞具有廣泛的抑制腫瘤功能[24]。在腦腫瘤、乳腺癌、胃癌、結直腸癌、胰腺癌、肝癌和骨腫瘤、頭頸部鱗狀細胞癌等多種腫瘤組織中，EBF3呈甲基化或者缺失[25～28]。EBF3在正常的細胞系表達,但在腦腫瘤細胞系中沉默，其表達可能被5-氮雜-2'-脫氧胞苷(5-aza-2′-deoxycytidine)和曲古抑菌素A(trichostatin A)重新激活[28]。研究結果表明，EBF3的表觀遺傳沉默是人類癌癥的一個普遍現象，EBF3甲基化可以做為腫瘤的表觀遺傳標志物，并且可以用抗癌藥物治療后逆轉，可能為腫瘤治療提供一個新思路。

2.2 KCNK15 KCNK通道是一類新型的鉀離子通道,與電壓依賴性鉀通道和內向整流鉀通道均有所不同,它具有4個跨膜片斷(tansmembrane segment，TM)和2個膜孔區(pore domain，P)。KCNK通道最初被稱為K2P通道(two-pore-domain potassium channels)，后被統一命名為KCNK通道。該家族共有17個亞族，系統命名依次為KCNK1～KCNK17。這種通道最初發現于酵母細胞中，廣泛分布于興奮和非興奮組織中，在心肌細胞上主要為TWIK、TASK和TREK。KCNK15(又稱為KT3.3、TASK5、TASK-5、K2p15.1)，位于染色體20q13.12區域，KCNK15島連接EST和外顯子BF195580，主要表達在腎上腺和胰腺，可能對這些器官中激素的分泌扮演重要的角色，在心臟、骨骼肌、睪丸、甲狀腺、唾液腺也少量表達。近30年研究發現，在腫瘤細胞中K+通道調控細胞增殖、抗細胞凋亡、腫瘤血管形成，侵襲和轉移擴散[29]。在腫瘤微環境中K+通道也可以調節免疫、炎性反應，促進腫瘤的發生和發展。用亞硫酸氫鈉焦磷酸測序檢測血液樣本雙向啟動子甲基化水平，在10個細胞系發現KCNK15甲基化,包括結腸癌、白血病、膀胱癌，在結腸癌細胞系中呈高度甲基化[30]。而通過DNA甲基轉移酶抑制劑(DAC)治療后，雙向啟動子的甲基化有不同程度降低，表明啟動子甲基化可以被藥物逆轉。大約25%的癌癥高甲基化啟動子相關的CpG島是雙向的，暗示KCNK15的雙向啟動子甲基化導致抑癌基因沉默，在腫瘤發生發展中可能是一個重要途徑。

2.3 TCERG1L 轉錄延伸器1系(transcription elongation regulator 1-like，TCERG1L)的基因位于10號染色體上。TCERG1L可能與TCERG1(轉錄延伸器1)有相似的生物學作用，TCERG1位于人類染色體5q32，TCERG1也被稱為TAF2S；TATA盒結合蛋白相關因子2S，CA150，轉錄因子CA150)，最初被確定為通過相對應答HeLa細胞核片段來調節人類免疫缺陷病毒1型(HIV-1)轉錄延長[31]。TCERG1由多個蛋白質結構域組成，最顯著的是在N-末端有3個WW結構域，在C-末端有6個重復的FF結構域。TCIRG1與血漿脂聯素關系密切[32]，血漿脂聯素是肥胖病、炎性反應、胰島素抵抗(IR)和糖尿病的關鍵調節劑。在基因芯片技術研究中顯示頻發的腫瘤特異性甲基化，TCERG1L最近已被確定為在結腸癌中的一個低頻的突變基因[33，34]。Kim等[35]研究發現TCERG1L可以增加炎性腸病(IBD)包括潰瘍性結腸炎(UC)和克羅恩病(CD)患者發展為CRC的風險。Yi等[36]通過突變基因的DNA甲基化分析證實TCERG1L在CRC甲基化頻率>90%。在大腸癌中TCERG1L甲基化和表達下調是腫瘤特異性的方式，可能是CRC前病變和癌變的無創性檢測的一個重要的生物標志物[37]。

2.4 原纖維蛋白-2(FBN2) 原纖蛋白(fibrillin，FBN)是具有高度同源性的氨基酸序列保守的多結構域架構，主要結構部件糖蛋白是細胞外與鈣離子結合的平均直徑為10 nm微纖維，FBN有2個成員FBN1和FBN2。FBN2是一種細胞外基質蛋白，由47個類EGF結構域組成,其中43個有一致的鈣結合序列，被含有固定模塊的8個半胱氨酸阻斷，固定模板是在隱藏的TGF-β1結合蛋白中發現的，模板由一個獨特的C端、N末端和一個富含甘氨酸的小結構域組成。它與彈性纖維在若干組織相關聯，被認為是作為一種αvβ3整合素配體，后者是一個已知的成形素。FBN2首先被發現表達在間質組織及上皮間質界面。FBN2優先定位于彈性組織，如彈性軟骨和主動脈內膜層。研究表明FBN2在肺發育起著關鍵的作用，在肺癌發展中扮演著重要角色[38]。使用高通量的基因芯片分析的方法確定在胰腺癌細胞株FBN2啟動子甲基化[39]。FBN2被證實原發性乳腺癌組織[40]、食管鱗狀細胞癌[41]、腎癌組織中FBN2啟動子區域頻繁甲基化，FBN2沉默可促進腫瘤發生[42]。Beggs等[43]用基因集富集分析(GSEA)比較癌與正常組織發現369組基因的高甲基化基因，FBN2甲基化的程度最高。Yagi等[44]證實FBN2 DNA在正常組織中度甲基化，FBN2在結腸癌組織中沉默，與KRAS基因突變(+)與較差的預后相關。Yi等[36]在結腸癌細胞系通過甲基化特異性PCR(MSP)檢測啟動子區域FBN2完全甲基化，并觀察到88%的管狀腺瘤和91%的絨毛狀腺瘤組織中FBN2甲基化，FBN2基因可能是CRC早期檢測的生物標志物。

2.5 NDRG4 Myc基因是一種原癌基因，通過對其靶基因的轉錄調控，參與許多生物學功能，如細胞增殖、凋亡、分化、發病機制等[45]。其下游調控基因家族(N-Myc Downstream-Regulated Gene，NDRG)，由NDRG1、NDRG2、NDRG3和NDRG4組成，NDRG在最近幾年被確定為一類新的Myc抑制基因。NDRG家族成員已被證明是腫瘤發生的關鍵，并可以用作許多疾病和癌癥的生物標志物[46]。NDRG1基因在大腸癌中高表達可以抑制腫瘤轉移[47]。NDRG2已被認為是一個候選抑癌基因[48]。NDRG4基因位于染色體16q21-q22.3，長度26個堿基，并包含17個外顯子，其中包括3個互補的DNA(cDNA)的異構體：NDRG4-B、NDRG4-B var和NDRG4-H。NDRG4主要表達在出生后早期的大腦、脊髓中的神經元和心臟，參與細胞分化和神經突形成過程。NDRG3和NDRG4被認為是抑癌基因，在生物過程和發病機制有重要作用[22]。NDRG4在細胞分化和軸突形成中扮演重要角色，是細胞周期進程、膠質母細胞瘤細胞系和癌癥干細胞濃縮細胞生存所必需的，是腦腫瘤獨立預后因素[49，50]，NDRG4參與調節細胞增殖、入侵和遷移[51]。在糞便中提取的NDRG4 DNA標志物的檢測結果表明，糞便DNA檢測在結直腸腫瘤、炎性腸病及胰腺癌非侵入性檢測的可行性[4，52～55]，而且糞便DNA測試比血漿DNA檢測更準確[11]。Melotte等[56]通過對糞便脫落的DNA檢測，證實NDRG4是無創檢測糞便樣本中大腸癌的潛在生物標志物。

3 MEs與腫瘤的關系及研究進展

CRC的發生由遺傳和環境等諸多因素相互作用所致，是一個涉及多基因、多階段的復雜過程，主要發生途徑為：(1)染色體不穩定(chromosome instability，CIN )途徑；(2)微衛星不穩定(microsatellite instability，MSI)途徑；(3)CpG島甲基化表型(CPG island methylator phenotype，CIMP)途徑；(4)鋸齒狀途徑。各條途徑存在特異性基因和表觀遺傳性改變，部分CRC的發生發展涉及2條及其以上途徑[57]。“MEs”一詞是描述在哺乳動物中等位基因的差異表達與表觀遺傳差異相關，而不是與遺傳異質性相關。Agouti viable yellow(AVY)小鼠是這種等位基因中一個顯著的例子，在人類中已經觀察到了相似的表現位點[1]。在AVY小鼠中，母體微量營養素可以在群體水平上改變DNA甲基化分布和相應的毛皮表型，暗示著MEs存在于相同的人類疾病的環境起源。進一步研究證明營養可以改變個體內在變異，但是個體內在的系統DNA甲基化在原腸胚形成之前出現，在其他的哺乳MEs中也出現相似的行為。最近在岡比亞兒童中PBL DNA的檢測支持了人類MEs的存在[15]。在這個地理區域，在遺傳平衡群體中一個連續的有前景的研究揭示，在嬰兒的DNA 甲基化中一些基因組位點被修飾，作為母性微量營養素補充的一個結果[58]。相關MEs定義基因表達篩查了35個基因:包括2個或更多的CpG位點，長度10 kb的基因組。這些基因的DNA甲基化的變化已經與各種形式的人類疾病有關，如哮喘、急性髓系白血病(ALOX12)、胃癌(EBF3)、乳腺癌(NAV1)、大腸癌(KCNK15，TCERG1L)、腎母細胞瘤(PCDHAs)、帕金森病(CYP2E1)[59]、躁郁癥(HCG9)[60]、膠質母細胞瘤(MGMT)[61]，提示MEs在腫瘤的潛在致病作用，并強調成為這些惡性腫瘤可能的發展起源。有研究證實DNA甲基化為DNA化學修飾的一種形式，能在不改變DNA序列的前提下，改變遺傳表現[58，59]。DNA甲基化可能使基因沉默化，進而使其失去功能。DNA甲基化在胚胎發育期間是必需的，在體細胞DNA甲基化的方式通常是高保真的傳給子細胞。異常的DNA甲基化模式與大量人類惡性腫瘤有關，抑癌基因的啟動子CpG島甲基化已作為一種常見的人類癌癥的標志[20，44]。SRBC基因DNA甲基化已作為CRC對奧沙利鉑耐藥的一個敏感性標志[62]。隨著液相色譜—質譜聯用儀(liquid chromatograph mass spectrometer，LC-MS)的廣泛應用，在不久的未來，DNA甲基化檢測可能在大規模人群實現。

4 結 論

綜上所述，腫瘤形成過程中涉及多種基因，單獨一種基因的多態不足以致癌，多種基因功能的積累才能引起調控細胞生長和增殖能力的改變，使個體對腫瘤的易感性產生差異。目前，雖然已有部分針對MEs及其相關基因的多態位點和惡性腫瘤關系的研究，但停留于實驗室研究階段，缺乏人群研究的佐證，研究樣本量不大。本研究只能提供流行病學線索并不能揭示其作用方式。可能的機制是由于MEs的變異導致轉錄活性的變化，從而對蛋白的表達水平產生影響。因此，MEs通路之間存在復雜的相互作用，需要更深入地研究分析其生物學功能，與腫瘤易感性的關系需要進一步驗證。

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黃躍南，E-mail:dr-huangyuenan@163.com

10.3969 / j.issn.1671-6450.2014.05.036

2013-11-23)