內皮型一氧化氮合酶基因多態性對一氧化氮水平的影響

王 進，杜 波(綜述)，單愛軍(審校)

(暨南大學第二臨床學院/深圳市人民醫院急診科，廣東 深圳 518020)

一氧化氮(nitric oxide，NO)是一種重要的細胞間信號轉導分子，參與體內各種生理、病理過程。NO體內合成的關鍵酶是一氧化氮合酶(nitric oxide synthase，NOS)。NO的體內生理合成過程復雜：在氧分子、還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(reduced nicotinamide adenine dinucleotide phosphate,NADPH)、四氫葉酸、血紅素、黃素單核苷酸(flavinadeninedinucletide，FAD)、黃素腺嘌呤二核苷酸、(flavinmononucleotide，FMN)及鈣調蛋白這些輔因子共同參與下，NOS利用L-精氨酸合成NO和L-瓜氨酸。NOS共三種亞型：內皮型一氧化氮合酶(endothelial NOS，eNOS)、神經型一氧化氮合酶(neuronal NOS，nNOS)和誘導型/免疫型一氧化氮合酶(inducible or immunological NOS，iNOS)[1]。其中，eNOS是由eNOS基因翻譯、轉錄生成。eNOS基因多態性與臨床疾病遺傳易患性研究，已成為分子生物學和基因組學的重要研究熱點。

1 NO

NO是一種親脂性的氣體分子，由一個氮原子與一個氧原子構成，它作為內皮衍生舒張因子，由美國三位科學家Robert、Louis和Ferid在1980年首次發現，當時他們發現NO對于調節血管張力和功能具有重要作用，后來進一步研究表明，NO還具有血管舒張、血壓調節、血流調節、抗血小板聚集與黏附、抗血管平滑肌細胞增生、抗脂蛋白氧化、抑制多種縮血管因子效應等更重要的生物學作用；此外，NO在神經系統中可作為神經遞質和神經調質而調節信息傳遞、激素分泌和維持睡眠-覺醒周期[1]。實際上，NO作為體內的重要生物活性物質，參與了機體多種生理功能與病理過程的調節。因此，NO的合成、釋放異常，必然會導致多種臨床疾病的發生、發展，尤其是心腦血管疾病。由于NO在生物體內半衰期短、代謝活躍，難以檢測與調控，通過基因水平闡明NO代謝異常的發生機制十分必要。

2 eNOS

NOS存在三種同工酶：eNOS、nNOS和iNOS，前兩者合稱結構性NOS(constructive nitric oxide synthase，cNOS)。eNOS分布于血管內皮細胞，參與血管功能調節，nNOS位于中樞和周圍神經細胞胞體內，后者作為神經遞質與神經調質參與信息傳遞[1]，eNOS與nNOS在生理狀態下持續表達，而iNOS主要存在于巨噬細胞等炎性細胞內，生理狀態下不表達，當機體出現炎癥、免疫反應時，誘導產生、釋放大量NO[2]，致使組織損傷與細胞凋亡[3]。生理狀態下，參與體內各種生理過程，尤其在心腦血管系統調節過程中，以eNOS最為重要，因此從分子生物學與遺傳學角度上探討eNOS基因多態性對體內NO水平的影響，對于臨床多種疾病的病因學研究有著十分重要的意義。

3 eNOS基因多態性

3.1基因多態性 在人群中，個體之間的DNA序列有90%是一致的，差異僅占10%，而正是這些差異存在，才決定個體間表型特征的差別，如面貌、體質量、身高、血型、性別的不同，當然，這些DNA序列的不同，也同樣會造成個體間對不同疾病易患性、對各種藥物反應性的差別[4]，這些個體間DNA序列的差異，遺傳學稱基因多態性。大量研究表明，eNOS基因多態性可能影響體內NO水平，從而影響各種臨床疾病的發生、發展[1]。

3.2eNOS基因多態位點 人類eNOS基因位于第7號染色體上的7q35～36區，整個基因跨距2.1 kb，含26個外顯子和25個內含子，經轉錄、翻譯及修飾后產生一個相對分子質量為135×103，含1203個氨基酸序列的eNOS。目前已發現eNOS基因多態性10余種，eNOS基因主要含大量單核苷酸多態性位點(single nucleotide polymorphisms，SNP)，另外，還有一個位于第4內含子區數目可變性串聯重復序列多態性(variable number of tandem repeat,VNTR)和一個CA重復微衛星標記[1]。在這些多態性中，目前研究證實與NO的產生效率及臨床各種疾病密切相關的有：4內含子區VNTR，據重復次數不同，有4次、5次和6次重復三種多態性，稱4a/b/c多態性；位于啟動子區的第786號位點的T置換為C，稱T786C多態性；位于第7外顯子區的第894號位點G置換為T，稱G894T多態性[1]。

4 eNOS基因與NO水平

4.14b/a與NO eNOS基因第4內含子存在一個含27個堿基對的重復序列，該重復序列為[GAAGTCTAGACCTGCTGC(A/G)GGGGTGAG]，該序列第19號位點亦存在多態性，是A與G的置換，序列上絕大多數為5次重復，稱4b，少數為4次重復，稱4a。另外，尚有報道存在此6次重復(4c)，但因其在各種群中實屬罕見，統計學上常可忽略。雖然27 bp VNTR在轉錄mRNA后被剪切，也不影響eNOS的結構，但此多態性可能通過干擾mRNA剪切效率或與其他功能位點連鎖共同作用而影響NO水平[5]。對于4a等位基因對NO水平的作用，目前研究結果并不一致。Tsukada等[5]通過檢測413名健康人eNOS基因4b/a多態性與血清一氧化氮代謝物(NOX)水平發現，4a/4a基因攜帶者的基礎NO代謝物水平是28.8 mmol/L，4b/4a基因攜帶者的基礎NO代謝物水平為31.4 mmol/L，而4b/b基因攜帶者NO代謝物水平為35.5 mmol/L，統計分析顯示，4a/4a純合子的血漿基礎NO代謝物水平比4b/4b純合子降低20%，這項研究表明：4a等位基因的攜帶顯著降低體內NO代謝物水平，從而間接提示4a等位基因可能降低體內NO的產生水平。Yokoyama等[6]在進一步研究4b/a多態性與高血壓遺傳易患性關系的過程中，檢測血漿NO代謝物水平，亦得出與Tsukada等[5]相似的結論。黃惠彬等[7]在研究eNOS基因多態性與高血壓、糖尿病的關系時，同時測定空腹血清NOX水平，結果發現，在對照組內，aa+ab基因型空腹血清NOX顯著低于bb基因型(P<0.05)，說明a等位基因的存在可能減少基礎的內皮型NO釋放。關于機制方面報道不多，Senthil等[8]在對美國墨西哥人群的離體臍靜脈內皮細胞研究后發現，4a/4a純合子細胞中eNOS mRNA表達水平最高，但eNOS蛋白水平與酶本身活性卻有所降低，這種矛盾的出現，尚需進一步研究。

值得注意的是，Wang等[9]通過對33個產后胎盤進行檢測發現，雖然攜帶4a等位基因的個體eNOS蛋白水平降低(0.48±0.11 vs 1.05±0.10,P<0.01)，但eNOS酶自身活性卻大大提高，攜帶4a等位基因的酶活性高于非4a等位基因個體7倍[(4556.2±255.4) cpm/(mg·min) vs (621.8±180.5) cpm/(mg·min),P<0.01]，aa純合子較bb純合子NOX水平顯著增高[(64.9±7.5) mmol/L vs (30.2±3.1) mmol/L]。但鑒于研究對象是離體的胎盤組織，其是否能代表在體組織，尚需要進一步研究明確。日本也有研究指出，抑郁癥患者中4b/4b純合子血漿NOX水平顯著低于4a攜帶者[10]。Hassan等[11]學者的研究也支持此觀點，認為4a等位基因可能通過影響eNOS基因啟動子區的激活而提高NO水平。

4.2T786C與NO T786C(rs2070744)指位于eNOS基因啟動子區第786位點的胸腺嘧啶(T)轉換為胞嘧啶(C)。啟動子直接與基因轉錄啟動相關，故此部位核苷酸轉換可能通過改變啟動子區活性而影響體內NO生成效能[8]。為證明此觀點，Nakayama等[12]學者對日本人群進行了研究，主要內容是eNOS基因啟動子區三個多態位點(T786C、A922G和T1468A)與冠狀動脈痙攣的關系，結果發現，冠狀動脈痙攣患者eNOS基因啟動子區突變的發生率顯著高于對照組，采用多元Logistic回歸分析逐步剔除其他因素后，T786C的突變顯著降低eNOS基因啟動子的活性(P<0.05)，而另外兩個多態性位點則未見明顯功能，位于啟動區的T786C突變顯著降低啟動子區活性，影響eNOS基因轉錄的起始過程，eNOS合成減少，從而NO生成減少。Miyamoto等[13]對此作了進一步的機制學研究，他們從海拉細胞中純化出一種復制蛋白A1，這種蛋白普遍存在于人體細胞中，尤以脈管系統的細胞最為豐富，它是一種單鏈DNA結合蛋白，在基因修復、復制及重組過程中具重要功能，Miyamoto等[13]通過體外試驗發現，它可以特異性結合到存在T786C突變的eNOS基因啟動子區，起到阻遏蛋白的作用，從而抑制啟動子區活性，以致減少NO生成。李東寶等[14]在研究T786C多態性與高血壓病關系時，同時利用硝酸還原酶法測定空腹血清NOX水平，結果顯示高血壓組CT+CC基因型和C等位基因頻率顯著高于對照組；TT基因型的血清NOX水平顯著高于CT+CC基因型[(77.68±33.36) μmol/L vs (67.15±24.22) μmol/L，P<0.05]，從而得出結論：C等位基因攜帶者可能通過減少eNOs的釋放參與原發性高血壓發病。Ohtoshi等[15]在研究糖尿病與eNOS基因多態性關系時也有相似發現，在糖尿病患者中，攜帶C等位基因與不攜帶C等位基因相比，血清NOX水平顯著降低。

然而，對此亦存在不同觀點。Senthil等[8]對美國墨西哥人群的離體臍靜脈內皮細胞研究中，同時測定eNOS mRNA水平、eNOS蛋白水平、催化活性以及NOX水平，結果通過方差分析得出結論：CC基因型攜帶者的eNOS mRNA水平比CT或TT基因型的顯著降低(0.07±0.04 vs 0.20±0.07，0.18±0.05，P<0.05)，但三者之間eNOS蛋白水平、催化活性以及NOX水平并未見明顯差異，但由于他們的研究中樣本量較小，出現CC純合子的個體僅有3個，是否可代表全體人群，尚不能過早下結論。Ikenouchi-Sugita等[10]對抑郁癥患者研究中發現，TT純合子血清NOX水平比G純合子顯著增高。Salimi等[16]在針對冠狀動脈粥樣硬化與T786C的研究中發現，在對照組及研究總人群中，786C攜帶者具有更高的血清NOX水平，然而在冠狀動脈粥樣硬化病例組中，并未發現T786C多態性與NOX水平的相關性。

有報道稱[11]，T786C位點與4b/a位點存在連鎖不平衡現象，即4a等位基因與786C突變存在重要的連鎖效應。Hassan等[11]在研究eNOS基因多態性與腦小血管疾病的過程中，共招募病例組300例和對照組600例，使用聚合酶鏈反應-限制性片段長度多態性方法檢測eNOS基因4b/a和T786C位點，使用格里斯法測定血清NOX水平，結果發現，T786C可以影響血清NOX水平，但必須當4a等位基因存在時，此種影響才能表現出來，4a等位基因的存在可能通過激活啟動子區活性而升高NO水平。

4.3G894T與NO G894T多態位點位于eNOS基因第7外顯子第894位點(rs1799983)，由G置換為T，將使轉錄翻譯后的eNOS的第298氨基酸位點的谷氨酸(Glu)被替換成天冬氨酸(Asp)，因此習慣上又稱之Glu298Asp多態性。由于G894T多態性涉及所編碼氨基酸序列的變化，相關研究和報道較多。Veldman等[17]為了探索G894T多態性與NO水平的關系，針對41名健康個體，經橈動脈先后以三種不同速度輸入NOS抑制劑，即N-單甲基-L-精氨酸(L-NMMA)，觀察試驗對象前臂血流變化情況，結果發現，含298Asp個體對L-NMMA反應顯著降低，由此推斷，894T多態性可能降低基礎NO水平。印度有研究表明[18]，在冠狀動脈粥樣硬化性心臟病(冠心病)患者中，GG純合子血清NOX水平顯著高于GT或TT者(P<0.01)。Senthil等[8]發現，含894T基因轉錄的eNOS mRNA量增多，但eNOS蛋白的量及活性均降低，體內NOX的量亦隨之降低。有研究表明，由298Asp和298Glu構成的eNOS，兩者米氏常數(Km)和酶促反應的最大速度(Vmax)是相同的，此部位的氨基酸替換是發生于蛋白質外表面的回文結構中，并不會干涉酶的活性中心及酶的二聚化過程[19]。Tesauro等[20]通過細胞轉染技術研究發現，經786C等位基因轉錄、翻譯后生成的帶有298Asp的eNOS更易被內源性蛋白酶裂解，生成100×103和35×103的兩個片段，而298位為Glu的eNOS并不會被裂解，從而可以說明突變后生成的eNOS自身穩定性下降，進而影響體內NO水平。Krolewski等[21]發現，Glu298Asp突變造成氨基酸改變后，致使原本局部α螺旋結構更為緊密，從而影響蛋白質功能及NO水平。

然而，目前已有的研究和報道并不都是一致的。Gad等[22]在研究G894T多態性與急性心肌梗死的過程中發現，在埃及人群中，并未出現G894T多態性與血清NOX水平有相關性。Golser等[23]研究了Glu298Asp突變對純化重組eNOS在酵母中表達功能的影響，并未發現其對eNOS酶的功能造成影響，因此無法認為G894T多態性導致內皮功能失調。但是，該研究中的實驗系體外實驗，不能肯定其反映了人體的真實生理狀況。此外，還有相反的觀點，Yoon等[24]在進行冠心病患者的血清NOX與eNOS基因多態性關系研究中發現，在健康對照組中，GT+TT的個體，其血清NOX水平顯著高于攜帶GG基因的個體(136.1 mmol/L vs 64.5 mmol/L，P=0.001)，而在冠心病組中卻未見此種差別。

5 結 語

這些基因多態性的發生可能造成基因在翻譯、剪接、轉錄及修飾過程中受到影響，從而改變eNOS蛋白的水平或活性，使血漿中內皮源性NO水平變化。值得注意的是，體內NO水平的高低并不僅僅受到eNOS的影響，還受nNOS、iNOS影響，此外也受到疾病狀態及藥物影響，如冠心病時使用的NO釋放制劑(硝酸甘油等)。目前，已知的對于eNOS基因多態性的功能研究并不一致，其原因推測可能除與種族引起遺傳差異或飲食、環境因素有關外，還存在其他眾多機制的影響，值得進一步探討。

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