Geminin：一個潛在的腫瘤治療靶點

郭建強(綜述)，李素娟(審校)

(內蒙古醫科大學附屬醫院 1心血管內科， 2消化內科，呼和浩特 010050)

理想的腫瘤治療應該能夠特異性地靶向腫瘤細胞而不損傷正常細胞。尤其是分子靶向治療，近年來已受到密切的關注，并在臨床實踐中取得了良好的療效。分子靶向治療，是針對某一特異位點(如細胞內部的一個蛋白分子)來設計相應的治療藥物，藥物進入細胞內作用于該位點，使腫瘤細胞特異性死亡，而不會波及腫瘤周圍的正常組織細胞。新近發現的小分子蛋白細胞周期因子Geminin，能夠調控DNA的復制，其功能在正常細胞和腫瘤細胞中存在顯著的差異，有望成為新的腫瘤治療靶點。

1 Geminin的分子結構及基本功能

1.1Geminin的分子結構 Geminin是一個相對分子質量為25×103的核蛋白，N末端包含一個和細胞周期蛋白破壞框同源的短氨基酸序列(RRTLKVIQP)，這個序列開始于第33個氨基酸殘基，為泛素化位點；Geminin的中心部位第118～152位的氨基酸序列能夠形成卷曲螺旋結構域，此結構域含有5個7肽重復單位，是蛋白質與蛋白質相互作用的位點。Geminin第50～116之間的堿性氨基酸簇是一個核定位信號域[1]。Geminin是轉錄因子E2F的靶基因，它的表達受pRb/E2F通路的調節。E2F在行使其轉錄活化因子作用前必須與腫瘤抑制因子pRb分離，非磷酸化的pRb與E2F形成的復合物起抑制轉錄的作用，pRb磷酸化后釋放E2F，啟動Geminin基因的轉錄[2-3]。

1.2Geminin的基本功能 Geminin在DNA復制的起始發揮作用，抑制DNA的重復復制，維持基因組的穩定性。在細胞增殖過程中，確保基因組的穩定性與完整性是至關重要的，細胞必須保證在一個周期內，DNA僅被復制一次，這一過程主要是由前復制復合物(pre-replicative complex,pre-RC)周期性地形成和解離來實現。DNA復制的起始需要一些被稱為復制許可因子的蛋白質連續結合到染色質上，其過程如下：在Cdc6(cell division cycle 6)、Cdt1和復制起始因子ORC(origin recognition complex)的協同下，有解旋酶活性的微小染色體維持蛋白2-7(mini chromosome maintenances protein 2-7,Mcms2-7)結合到染色質上，與Cdc6、Cdt1和ORC共同組成pre-RC，結合到染色體的復制起始點，DNA解螺旋，在DNA聚合酶等的作用下，DNA復制啟動。DNA復制啟動后，上述各個因子便會通過不同途徑失活，保證在一個細胞周期內DNA僅被復制一次[4-5]。Geminin可通過抑制Cdt1的功能，確保DNA僅被復制一次。

最初研究發現，Geminin能夠抑制DNA的復制，主要在DNA復制的起始發揮作用，其機制是通過阻止微小染色體復合物Mcms結合到染色質上[1]。隨后研究發現，Geminin抑制DNA復制的功能是通過在S期與Cdt1的結合，從而阻止Mcms結合到染色質上[6]。Cdt1被認為是復制許可因子中最重要的蛋白質，因此對Cdt1的調控在細胞復制調控中尤為重要。Geminin可以阻遏Cdt1的作用，抑制DNA的復制，DNA復制開始后，Geminin便與Cdt1結合，而這種結合阻遏了Mcms2-7裝載到染色體上，從而使pre-RC從染色質上解離，抑制DNA復制的再次啟動。

在HeLa細胞和人乳腺癌細胞系中采用G/S-TdR雙阻斷法同步化細胞于S期早期然后釋放，通過不同的時間點收集細胞，用免疫印跡法檢測Geminin蛋白的表達，同時用流式細胞技術檢測細胞周期的時相，發現Geminin表達于S期、G2期和大部分M期，在G1期不表達。進一步發現Geminin是由后期促進復合物泛素化途徑在M期的后期降解，在早S期，APC失活，Geminin開始重新表達[1,7]。Geminin特異性的表達于細胞周期S期的特點也說明其主要功能是在S期調控DNA的復制。

2 Geminin在腫瘤中的表達及其在腫瘤預后判斷中的作用

研究表明，Geminin能夠抑制非洲爪蟾卵的DNA復制及其細胞周期的進程，因此認為其能夠抑制細胞的增殖并且是一個腫瘤抑制基因[1]。后續的研究表明，Geminin主要在機體處于不斷增殖狀態的細胞中高表達，如淋巴細胞、雄性生殖細胞及上皮細胞，而處于靜止的細胞(如心、神經、腎、肺)或靜止細胞中，Geminin的表達水平則較低甚至不表達[8-9]。與正常細胞相比，腫瘤細胞以及腫瘤來源的細胞系，Geminin普遍存在高表達，并且其表達水平與腫瘤的增殖活性是相關的[10-12]。在少突膠質細胞瘤中，Geminin的表達不但被上調，而且Geminin的標記指數和Ki67(一種增殖細胞相關的核抗原，常被作為細胞增殖的標志分子)的標記指數存在相關性[13]。由于Mcm2、Ki67、Geminin表達于細胞周期的不同階段，聯合檢測三個指標可以確定腫瘤細胞群細胞周期的分布特點，綜合評估Mcm2、Geminin和Ki67的標記指數可以更好地界定腫瘤的增殖狀態，以及更好地預測患者的預后[14]。Geminin的表達水平還可作為膠質母細胞瘤預后獨立的預測因子，并且能夠評估處于增殖狀態的腫瘤細胞亞群，由于處于增殖狀態的腫瘤細胞對放療和化療敏感，Geminin可指導膠質母細胞瘤放療和化療[15]。Geminin標記指數可作為胰腺內分泌腫瘤新的預后指示因子[16]。與正常人相比，急性白血病患者的骨髓中Geminin的表達水平顯著升高[17]。Geminin在肺癌(腺癌型)中是過表達的，其標記指數與組織學分型及腫瘤分期等肺癌(腺癌型)臨床病理相關，并且是一個有價值的預后指示分子[18]。Geminin的表達水平還能評價人軟組織肉瘤的預后[19]。Geminin在唾液腺癌中是高表達的，并且能夠預測腫瘤的侵襲性及臨床預后[20]。上皮細胞間質化是指上皮細胞通過特定程序轉化為具有間質表型細胞的生物學過程，也是上皮細胞來源的惡性腫瘤細胞獲得遷移和侵襲能力的重要生物學過程[21]。最近研究表明，Geminin能夠通過影響Wnt通路和上皮鈣黏素的表達而影響上皮細胞間質化過程[22-23]。

Geminin在乳腺癌中的作用得到了充分的研究。在原發性乳腺癌發生的早期，Geminin在病發部位損傷區即已經過量表達。Montanari等[24]在人的乳腺癌細胞中轉染表達野生型Geminin質粒，建立穩定過表達Geminin的細胞系，發現過表達Geminin基因的細胞生長能力顯著增加，表現為細胞的倍增時間縮短，飽和密度和貼壁率增加，處于S期細胞的比例增加，錨定生長能力是一個重要的腫瘤生長特性，對于過表達Geminin基因的乳腺癌細胞，其錨定生長能力顯著增加。三陰乳腺癌特指雌激素受體、孕激素受體及人表皮生長因子受體2均陰性的乳腺癌患者。在三陰性乳腺癌中，Geminin是過表達的，并且與腫瘤干細胞的標記蛋白CD133有很強的相關性，這對于乳腺癌惡性程度的分子分層非常有用[25]。過表達Geminin的乳腺上皮細胞能夠在SCID小鼠中發展形成乳腺腫瘤并且維持其生長，進一步的研究表明，Geminin的這種誘導惡性轉變作用通過抑制極光激酶B(Aurora B，AurB)的活性而實現，AurB能夠活化多種參與染色質凝集分離過程的蛋白質，其抑制劑也是一類重要的抗腫瘤藥物，實驗表明，Geminin過表達能夠使乳腺上皮細胞增加對AurB抑制劑的抵抗性，因此抑制Geminin的活性能夠增加細胞AurB抑制劑的有效性[26]。

上述研究表明，Geminin在多種腫瘤細胞系及腫瘤組織中均存在高表達，其表達水平對腫瘤患者的預后具有指示作用，Geminin在腫瘤的發生及發展過程中具有重要的作用。

3 降低Geminin的表達水平對細胞的影響

最初在非洲爪蟾胚胎的實驗研究表明，利用反義寡核苷酸技術下調爪蟾胚胎Geminin的表達后，胚胎細胞停止在G2期，進一步的機制研究表明，缺乏Geminin的細胞未能進入M期是由于激活了Chk1(checkpoint kinase 1)依賴的細胞周期檢驗點而引起細胞周期的停止[27]。在果蠅胚胎細胞系SD2應用RNA干擾技術下調Geminin的表達引起了DNA的重復復制，出現大量六倍體甚至八倍體的細胞，在這些細胞中摻入5-溴脫氧尿嘧啶核苷，發現這些細胞仍在進行著DNA的復制，同時應用4′,6-二脒基-2-苯基吲哚標記細胞核發現這些細胞出現了巨大的細胞核[28]。這些研究結果表明，Geminin在DNA復制的穩定性上具有重要的作用。

Geminin對于真核細胞DNA復制的調控作用也得到了廣泛的研究。在人骨肉瘤細胞系U-2OS、人結腸癌細胞系(HCT116)作關于Geminin功能的研究表明，下調Geminin會導致這些細胞發生DNA重復復制，出現多倍體細胞和巨大的細胞核，細胞周期停止于G2期，同時也發現Chk1依賴的細胞周期檢驗點也是激活的，用咖啡因和7-hydroxystaurosporine(UCN-01)廢除Chk1依賴的細胞周期檢驗點活化，這些異常DNA復制的細胞進入M期，但無法完成有絲分裂，隨后發生細胞死亡[29]。另一項研究表明，在HCT116和人肺癌細胞系(H1299)利用RNA干擾技術下調Geminin的表達會導致DNA的重復復制，同樣出現了大量超過四倍體的細胞，這些細胞展現出了巨大的細胞核，DNA的重復復制激活了G2/M細胞周期檢驗點，細胞周期停止于G2期，同樣，廢除G2/M細胞周期檢驗點的活化也引起了細胞的凋亡，同時下調Geminin的靶作用蛋白Cdt1可以阻止細胞發生DNA的重復復制[30]。近期研究顯示，在人骨肉瘤細胞系U-2OS敲低Geminin表達的細胞都可以完成大部分S期的進程，DNA重復復制主要發生在晚S期和G2期[31]。

在正常細胞中，Geminin對于DNA復制的調控作用似乎并不是必要的。Geminin主要表達于細胞周期的S期和G2期，在M期的后半段由后期促進復合物泛素化途徑降解，所以Shreeram等[32]構建了一個泛素化破壞框突變的非降解的Geminin表達質粒，轉染人骨肉瘤細胞U-2OS和人胚胎成纖維細胞IMR90，發現可誘導前者的凋亡，而對后者則沒有影響。在正常組織來源的血管平滑肌細胞改變Geminin的表達水平對其增殖沒有影響[33]。Zhu等[34]更進一步地對比了多種腫瘤細胞系及正常細胞系Geminin功能差異，該研究選擇了來源于結腸、乳腺、肺、腎臟、骨、腦、皮膚的正常細胞系和對應的腫瘤細胞系，發現小分子干擾RNA介導的Geminin表達下調導致DNA重復復制、細胞增殖停止僅在腫瘤細胞系中發生，而在正常細胞系中則沒有觀察到這一現象。由此可以得出，對于正常細胞DNA的復制，Geminin并不必要。

4 小 結

綜合目前的研究結果可以看出，Geminin在腫瘤的發生、發展中具有重要的意義，不僅在腫瘤細胞及腫瘤組織中高表達，能夠用來評價腫瘤的進程及預后，而且降低Geminin的表達水平對腫瘤細胞的生長有顯著的抑制作用。但在正常細胞中，降低Geminin的表達水平對細胞的生長似乎并沒有影響。靶向Geminin的治療可能是一個理想的腫瘤治療方案，可以利用RNA干擾等基因沉默技術，降低細胞Geminin的表達水平，這樣可以抑制腫瘤細胞的生長而不影響正常細胞的生長，從而達到靶向治療腫瘤的目的。

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