基因芯片技術(shù)在感染性疾病研究中的應(yīng)用

趙 輝(綜述)，張曉娟(審校)

(陜西理工學(xué)院體育學(xué)院，陜西 漢中 723001)

基因芯片技術(shù)是20世紀(jì)90年代初，由Schena[1]所開創(chuàng)的一項高新技術(shù)[1]。它將特定的寡核苷酸片段或基因片段規(guī)則有序地以極高的密度排列在片基上，與熒光標(biāo)記的樣本按堿基配對的原理同步雜交，應(yīng)用共聚焦熒光檢測系統(tǒng)掃描、計算機(jī)分析和統(tǒng)計數(shù)據(jù)，可對基因的序列或功能進(jìn)行研究。芯片技術(shù)為具有高通量、微型化、精確度高和對比性強(qiáng)的特點，為研究感染性疾病提供了新的思路和方法。目前應(yīng)用芯片技術(shù)對感染性疾病的研究主要集中在對感染性疾病快速檢測和診斷、感染性疾病的耐藥性研究、感染性疾病的致病機(jī)制等方面。

1 感染性疾病的檢測和診斷

感染性疾病(如肝炎、結(jié)核、艾滋病等)影響人類健康和壽命，一般的細(xì)菌感染很常見，快速有效地對這些疾病作出檢測和診斷有助于盡早治療，選擇合適的敏感藥物。傳統(tǒng)的檢測方法依靠生化血、血清學(xué)或者是分離培養(yǎng)來進(jìn)行。診斷的特異性不高，不能準(zhǔn)確判斷出病原體的類別和種屬，檢測速度較慢。現(xiàn)代分子生物學(xué)檢測(如免疫測定和聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)等)雖然可以節(jié)省部分時間，但可檢測的病原體種類很少[2]。運用芯片技術(shù)檢測感染性疾病的原理是以待測病原體的特征基因片段制備探針，將患者血清中的病原體DNA或RNA擴(kuò)增并熒光標(biāo)記，通過雜交后檢測熒光來判斷病原體種類，特點是樣品需要量少、準(zhǔn)確性高、檢測速度快，并且可以同步檢測多種病原體和多個樣本。這類芯片還能對病原體進(jìn)行基因分型和菌種鑒定，例如根據(jù)常見病毒特征序列設(shè)計的肝炎診斷基因芯片可以快速檢測出患者是否患有肝炎，以及病毒的種類、亞型，還可以檢測出耐藥的情況[3-4]。朱京京等[5]針對人類免疫缺陷病毒1，gag基因區(qū)基因的相對保守區(qū)設(shè)計探針，制備了用于人類免疫缺陷病毒快速檢測的基因芯片，檢出符合率達(dá)到98.5%。黃迎春等[6]針對中國流行的7種性傳播疾病制備了快速檢測基因芯片。周琦等[7]和陶生策等[8]分別制備了用于快速檢測SARS的基因芯片并已初步應(yīng)用于臨床。王元倫等[9]和唐雨德等[10]構(gòu)建了用于檢測水中微量鉤體的基因芯片，最低檢測濃度達(dá)到5條鉤體/100 mL水。隨著近年來研究的不斷深入和成熟，基因芯片診斷技術(shù)已經(jīng)成為臨床疾病診斷的重要新內(nèi)容，衛(wèi)生部在2009年公布了《基因芯片技術(shù)診斷管理規(guī)范》是芯片技術(shù)用于疾病診斷更加規(guī)范科學(xué)[11]。

2 感染性疾病的耐藥性研究

目前多重耐藥菌的感染患者越來越多，常引起區(qū)域內(nèi)的交叉感染和傳播，對兒童和老人尤其具有危害，例如2010年在印度、英國、日本等國引起小規(guī)模流行的NDM-1(產(chǎn)Ⅰ型新德里金屬β內(nèi)酰胺酶泛耐藥腸桿科細(xì)菌)細(xì)菌，含有新型的NDM-1酶，可使所有含有β內(nèi)酰胺環(huán)的藥物失效[12-14]。由于耐藥菌增多，全球結(jié)核病形式急劇惡化，結(jié)核病在世界范圍內(nèi)呈快速上升趨勢。結(jié)核分枝桿菌如果同時耐受異煙肼和利福平，結(jié)核病將會很難治療，病死率大大增加，隨著艾滋病的流行和流動人口的增長，結(jié)核疫情已不容樂觀。造成耐藥菌大量出現(xiàn)的主要原因是無指征的濫用抗生素，選擇性地殺死敏感菌從而降低了對耐藥菌的抑制作用。對于結(jié)核病的用藥，臨床上的藥敏試驗很難起作用，主要原因是測定時間周期長(結(jié)核菌生長緩慢，耐藥菌的生長更加緩慢)、精度不高、難以在疾病早期根據(jù)耐藥性制訂治療方案，而基因芯片用于快速檢測耐藥性，指導(dǎo)個體化用藥具有非常重要的意義。Wilson等[15]運用基因芯片技術(shù)研究發(fā)現(xiàn)，肺結(jié)核桿菌中的脂肪酸合成酶Ⅱ、鐵轉(zhuǎn)運ATP結(jié)合蛋白C、完整的膜轉(zhuǎn)運蛋白、酰基輔酶A脫氫酶、烷基過氧化氫還原酶C蛋白的基因改變和耐藥性有關(guān)。Gingeras等[16]創(chuàng)造了利用RNA聚合酶β亞基基因的寡核苷酸芯片快速檢測結(jié)核分枝桿菌的方法，并發(fā)現(xiàn)該基因的變異與細(xì)菌對利福平的耐藥性有關(guān)。李峰等[17]應(yīng)用RNA聚合酶β亞基基因的基因芯片檢測該基因在結(jié)核菌株中的變異程度的方法對76株臨床分離的利福平耐藥株進(jìn)行了檢測，突變檢出率為85.5%。戎奇吉等[18]運用芯片技術(shù)研究了結(jié)核分枝桿菌過氧化物酶催化酶基因突變及其與異煙肼耐藥相關(guān)性，發(fā)現(xiàn)結(jié)核分枝桿菌過氧化物酶催化酶基因S315突變與異煙肼耐藥密切相關(guān)。上海博星基因芯片研究所研發(fā)的結(jié)合桿菌耐藥檢測芯片以臨床標(biāo)本(痰液)為模板，通過多重聚合酶鏈反應(yīng)擴(kuò)增并熒光標(biāo)記雜交，具有較高的特異性和快速檢測的優(yōu)點。

3 感染性疾病致病機(jī)制的研究

基因芯片可以整體分析病原體的所有致病因子，全面研究病原體入侵宿主，逃避防御機(jī)制，宿主體內(nèi)的轉(zhuǎn)移，毒力基因的表達(dá)等因素。一般可分為兩個方面的研究。

3.1宿主在感染病原體后的機(jī)制 研究宿主在感染病原體后的一系列生理、病理改變及致病的分子機(jī)制，宿主的個體差異(年齡、性別等)對致病的影響。通過芯片技術(shù)篩選出宿主感染前后細(xì)胞內(nèi)基因的表達(dá)變化，這些變化可能會和疾病的發(fā)病機(jī)制有一定的關(guān)系，宿主在感染病原體后發(fā)生改變的基因很多，一般的方法難以全面檢測，基因芯片由于高通量的優(yōu)勢而被廣泛運用。張怡軒[19]制備了含有4096個基因的芯片，檢測了溶血素基因LA1029對人肝表達(dá)譜影響，篩選出了90個具有明顯表達(dá)差異的基因(涉及肝細(xì)胞的生長、分化、代謝、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等)。趙雁林等[20]研究了626個免疫相關(guān)基因在結(jié)核病患者體內(nèi)的表達(dá)差異，篩選出了53個差異性表達(dá)基因，其中16個細(xì)胞增殖相關(guān)基因，14個免疫應(yīng)答基因，20個信號轉(zhuǎn)導(dǎo)有關(guān)基因，3個其他免疫相關(guān)基因，為進(jìn)一步研究結(jié)核并對宿主免疫功能的影響打下了基礎(chǔ)。

3.2病原體在致病過程中的基因調(diào)控 通過對比不同毒力的病原體之間基因表達(dá)的差異性，或研究病原體在宿主內(nèi)環(huán)境誘導(dǎo)下發(fā)生的基因表達(dá)改變，進(jìn)而篩選可能的致病基因。如發(fā)現(xiàn)化膿性鏈球菌血清型M18具有編碼A型化膿性鏈球菌毒素和兩種未知化膿性毒素同源物的基因,霍亂弧菌的霍亂毒素體內(nèi)表達(dá)與體外雖然并無差異，但存在獲取營養(yǎng)的基因表達(dá)增強(qiáng)[21-22]。另外，運用基因芯片技術(shù)還可以檢測基因突變對病原體毒力的影響。Madsen等[23]通過模擬豬體內(nèi)溫度刺激豬肺炎支原體，發(fā)現(xiàn)該病原在熱激條件下發(fā)生了明顯的基因表達(dá)差異。

4 展 望

在基因芯片技術(shù)不斷發(fā)展的過程中，仍有許多技術(shù)問題需要完善，如芯片實驗的可重復(fù)性操作、精確定量、芯片片間數(shù)據(jù)的比較、芯片實驗的標(biāo)準(zhǔn)化、雜交后芯片的保存等。芯片成本價格高昂，不利于基因芯片技術(shù)的普及。我國在多方面缺少高端技術(shù)和專利權(quán)也影響到國內(nèi)應(yīng)用基因芯片技術(shù)進(jìn)行科學(xué)研究。與國外相比，我國在應(yīng)用基因芯片技術(shù)對感染性疾病的研究中存在的問題大多是重復(fù)國外研究、缺乏創(chuàng)新、實驗簡單沒有技術(shù)含量、實驗過程不規(guī)范、對芯片技術(shù)過分夸大和炒作。隨著基因芯片技術(shù)的不斷發(fā)展和完善，更多專業(yè)科研人員的共同努力，將會有更多種類、更高技術(shù)含量的基因芯片出現(xiàn)，在對疾病的診斷、預(yù)防、發(fā)病機(jī)制的研究中發(fā)揮更大的作用。

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