臨床分子病理檢查的發展與展望

□張品南ZHANG Pin-nan 馮國飛FENG Guo-fei 陳艷梅CHEN Yan-mei 黃益HUANG Yi

一直以來基于組織形態學特征的病理學診斷是腫瘤診斷的“金標準”和臨床治療的基礎[1]，但越來越多的證據表明：患同一組織學類型，同一TNM分期的腫瘤如采用相同的治療方案，患者治療的反應和預后并不一致。事實上，腫瘤，特別是惡性腫瘤是一類分子水平上高度異質性疾病[2]，傳統病理形態學診斷已不能適應現代腫瘤診治的需要。隨著現代生物技術飛速發展，腫瘤的病理診斷已從表型（phenotype）分析發展到表型和基因型（genotype）結合分析代表著當代醫學的革命性進步。臨床分子病理學，或稱分子診斷，已成為當今迅猛興起的病理亞學科之一。它從核酸水平（DNA和RNA）研究疾病發生發展規律來揭示疾病外源性基因在體內的存在和內源性基因突變及表達異常，是傳統形態病理學的有益補充和發展。即病理學已從傳統的病理形態學診斷邁向整合病理學（integrated pathology）時代[3]，這極大地豐富了病理診斷的內涵，使之從單純的病理形態學診斷擴展到對疾病的易感性和發病的風險性評估、疾病的預防、預后判斷、個性化治療（如靶向治療）方案的制定等診斷與指導性內容。整合性病理診斷會涉及到一些遺傳性腫瘤的篩查與預防，如遺傳性胃印戒細胞癌可通過鑒定E—cadherin (CDHE) 基因的生發性突變，進而篩查其相關親屬，對突變基因攜帶者進行全胃預防性切除以有效預防此類胃癌的發生。整合性病理診斷的開展將使病理診斷醫師融入患者的多學科治療團隊，指導治療，真正使病理醫師成為醫師中的醫師。如乳腺癌的診斷，現在一個合格而規范的診斷報告應包括組織學類型和分級，雌激素受體（ER），孕激素受體（PR）Ki-67以及HER2蛋白免疫組織化學結果HER2基因熒光原位雜交（FISH）檢測結果和致癌基因（BRCA1/2）。其中HER2基因檢測要準確、可靠和可重復性高的標準化檢測結果，其報告包括：（1）腫瘤存在異質性擴增所占比例；（2）兩群細胞的HER2、CEP17拷貝數及比值；（3）異質性擴增細胞是彌漫分布還是成簇分布；（4）是否有組織學改變。只有病理報告完整、全面、規范，臨床醫師才能實施規范而有效的個體化治療。又如肺腺癌的正確病理診斷對正確治療尤為重要，非小細胞肺癌在做治療前應檢測K-ras、表皮生長因子受體（EGFR）基因突變情況和EML4-ALK基因情況。EGFR基因突變提示該腫瘤對酪氨酸抑制劑（TKI）有治療反應，如果有K-RAS突變的患者對TKI會產生原發耐藥。一般非小細胞肺癌患者EML4-ALK陽性率很低，約為3%-7%左右。女性“亞裔”無或少量吸煙史的肺腺癌組患者能在EMFR-TKI中獲益，因而對此類病人的治療策略要改變[4]。分子病理診斷已從起步階段進入快速發展階段。隨著核酸序列分析方法的不斷進步，全基因組掃描不久將成為現實，與醫學生物信息學相結合的整合病理學診斷也將更上一層樓。

目前，國內分子檢查雖總體發展勢頭良好，但也存在一些問題。如規范化、標準化問題，如果不引起足夠重視，不僅會影響病理業界自身聲譽及其進一步發展，甚至給臨床診斷和靶向治療造成不良影響。針對目前我國分子病理診斷中存在的諸多問題，特提出建議如下。

盡快扭轉病理學科發展困境局面

目前，病理科面臨四大發展困境：其一人才流失嚴重。由于病理醫生職業風險大、任務重、待遇低[5]，大學本科畢業或研究生很少有人選擇臨床病理專業，甚至病理專業的研究生畢業后也不愿做病理而選擇其他臨床科室，有的已從事臨床病理工作多年并打下一定病理基礎的病理從業人員也千方百計離開病理科而轉至臨床科室或通過工作單位調動方式離開病理科，造成病理專業人才嚴重流失。有些基層醫院病理科甚至出現病理醫師后繼無人、隊伍斷層的現象。其二病理科被劃入醫技輔助科室頗具中國特色，因為在發達國家，病理科是標準的臨床科室。正因為是輔助科室，病理科也就享有了很多“輔助”待遇，不僅收入（獎金）提成比例低，有的病理科還要給臨床開檢查單醫師“好處費（回扣）”，這是很不合理的事情。其三病理檢查至少忙碌了三個工作日只收費60元（小標本）與臨床某些血液項目檢查在機器上過一過就幾百元甚至上千元形成強烈反差，這也與病理醫師的腦力和體力的高額投入形成了極大反差，也讓國外同仁費解。由于收費低，院領導不重視，制約了病理學科的發展。其四病理學科設置缺陷。我國的學科劃分將病理學和病理生理學一并劃分為基礎醫學二級學科，沒有設臨床病理學的三級學科，因此病理學培養研究生都歸為基礎醫學（科研型），無法招收和培養臨床型的病理研究生，甚至出現科研型病理專業畢業的研究生沒有資格參加執業醫師資格考試的怪現象，使得病理專業的碩、博研究生畢業后轉行分流，在本來病理研究生生源短缺的情況下造成進一步的病理專業人才流失。由于人才缺乏，我國病理診斷水平參差不齊，特別在中、小醫院，對于一些疑難病例存在較高的誤診率在所難免，導致患者或其家屬帶著病理切片到全國各地會診，造成不必要的經濟和醫療資源浪費及“醫鬧”事件的發生。

盡管病理科陷入發展困境的原因很多，既有國家宏觀政策上的失誤，也有醫院認識上的誤區。由于不合理的制度、市場導向、人才培養機制等多種原因綜合在一起，導致病理學科萎縮，人才流失嚴重，發展后勁乏力，問題的嚴重性已經到了必須要拯救的地步。為此，我們呼吁：從國家層面上要制定相應政策措施，亟待糾正政策偏差，制定更加合理的傾斜政策，從根本上改善病理科的地位。目前，國內醫療行業存在的“大檢驗，小病理”現象顯然不利于醫學的發展，更不利于醫療質量的提高。在臨床實驗室的認可逐漸呈現國際化趨勢及實驗室認可已在全球得到廣泛接受的現狀下，ISO15189應運而生[6]。ISO15189由ISO18025衍生而來，兩者均適用于醫學實驗室，除包括對檢驗人員的能力認證外，更注重“方法、機器、試劑”的認證管理；而病理學科診斷報告是更需要病理醫師個人能力的獨立性診斷報告，有別于檢驗科的更多依賴于設備、試劑和方法的檢測報告。因此，CNAL-CL33（醫學實驗室質量和能力認可準則在病理學領域的應用說明）認證病理科的技術室較為合適，而對病理醫師的認證參照ISO17020制定的病理醫師能力認證標準更為科學。歐美國家的病理科與我國的病理科的設置與概念是完全不同的，歐美國家的病理科包括解剖病理（相當于我國內地的病理科）和臨床病理（相當于我國內地的檢驗科），無獨立的檢驗科。檢驗科是在病理科領導與管理下開展工作的。我國由于科室設置的不科學，病理科與檢驗科在諸如細胞學、PCR的應用（PCR集中設置在檢驗科）等相關工作內容有交叉的領域難以“和諧”。分子醫學時代的到來，在臨床醫師熱衷的分子靶點治療的形勢下，病理醫師如何與檢驗科或其他實驗室協調應用PCR開展分子靶點檢測顯得左右為難。鑒于此，弱小的病理科與強大的檢驗科合并成立歐美模式下的“大病理”科室或者病理檢驗中心（行政主任由病理科擔任、行政副主任由檢驗科擔任）是更科學的學科設置。這有利于醫學事業的發展，也有利于醫療機構的科學管理，更有利于學科人才的穩定與培養。從醫院層面上要糾正認識上的誤區，明確病理科為非盈利科室，解除其盈利枷鎖。在收費提成、成本核算、人員配置、獎金分配等方面給予政策上的傾斜，并重點扶持，特別是獎金分配上應與臨床醫師同等待遇，因為病理醫師是醫師中的醫師，怎么能低人一等呢？從病理科自身層面上要處理好教學、科研與醫療三者的關系是病理科快速發展的一個棘手課題。歐美發達國家都有自己獨特的發展模式，德國的模式應該是我們可以試點改革的模式，德國病理科醫師人均診斷的病例數與我國大多數病理醫師相近或稍多，但他們有強大的技術員隊伍和秘書系統。這個系統在保證技術質量的前提下將技術含量低的工作有序轉移，以保證醫師集中精力作診斷。

分子病理檢查的規范化問題及建議

目前，我國病理科分子病理檢查發展不平衡，大多數分子病理檢查項目是由高校和商業公司運行操作。使得大部分基層醫院病理科醫師不知道分子病理檢查的技術操作和檢查結果的意義。因此加強我國病理醫師的分子病理技術培訓是目前健康穩定地發展我國分子病理事業的重要環節。由于種種原因，國內各家醫院在FISH、基因突變檢查、mRNA和其他一些項目檢測的實驗方法、試劑和設備等方面無統一規范標準，導致進行同樣的檢查項目，不同醫院得出不同結果，既讓人感到困惑，又引發醫療糾紛。因此，分子病理檢測方法必須規范和統一。現階段我國分子病理檢查主要包括FISH、基因突變檢查、mRNA等項目。其中FISH是最廣泛應用的基因擴增檢測技術。其診斷試劑主要是中國金菩嘉公司或者美國Vysis公司產品。美國Vysis公司產品雖然通過美國食品藥品管理局認證，但在中國尚未取得認證。為保證檢查質量，必須統一使用有認證的產品。影響FISH檢查結果的重要因素除試劑外，組織標本的固定也非常重要。進行FISH檢查的組織標本要求采用10%甲醛液固定，其量要達到組織的10倍。手術大標本固定時間為12-48小時，活檢標本不超過24小時。規范的標本固定是保證FISH檢查質量的重要步驟，基因突變檢測方法較多，包括直接測序法、TaqMan探針PCR法、ARMS法等。每種方法都有其優缺點。直接測序法是經典的突變檢測方法，價格低，結果也較可靠，但其檢測敏感性較TaqMan探針法和ARMS法低。多種突變檢測方法的存在給質量控制帶來困難。檢測的敏感性不同，也可能引起醫療糾紛。mRNA檢查也因檢查標本的多樣性（穿刺標本、新鮮組織標本和石蠟標本）和取材時間的差異性可能會在mRNA水平上出現非常大的差異性。雖然可以通過看家基因設立內參照，但目前尚無一種理想的方法來校正這種差異。而且國內實驗室判斷mRNA的標準通常采用國外雜志上論文的數據，尚無真正意義上的國家標準。為保證分子病理檢測質量，國內病理界應盡快聯合起來，研究制定適合我國國民不同組織的各種mRNA判斷標準。同時組建國家級、省級、市級三級網絡的分子病理檢測重點實驗室，分別由國家、省、市財政扶植，并制定完善的統一規范和質量控制標準來保證分子病理檢測質量。由于國內各單位給出的分子病理檢查報告形式多樣，各不相同，有的報告只給出檢查中采集的圖片，有的只給予結果。對此，也應制定全國統一的分子病理檢查報告標準。其內容除規范的分子病理檢查報告內容外，還應包括使用的試劑、方法、陰性和陽性判斷標準，3-5幅圖片以及結果的說明和臨床意義等相關內容。同時，制定統一的收費標準，并納入醫保范圍。

加強基因型分析與分子病理診斷

感染因子的基因型分析具有敏感、快速、特異和定位準確的特點。利用real-time PCR技術檢測病原微生物特異性基因片段，靈敏度可達到每次反應幾個拷貝，操作簡單易行，對生長周期長，培養條件苛刻的細菌及真菌極具優勢。對白血病長期化療合并嚴重鵝口瘡的患者，基因型檢測不僅能快速確診念珠菌感染，還可以對傳統培養法無法鑒別的白色念珠菌和近年發現的都柏林念珠菌等特異性菌種進一步分型，有助于及時選擇敏感藥物，挽救病人生命。對宮頸活檢標本采用原位雜交技術可顯示HPV 16/18型病毒E6、E7片段在細胞核內的定位和基因組整合狀態，有助于確定合理的癌前病變處理方案和隨訪原則。對結直腸腸病型T細胞淋巴瘤中EB病毒編碼小RNA（EBER）的檢測，可以明確可疑細胞的病毒感染狀態，有助于淋巴瘤的鑒別診斷。對于形態學診斷困難或不常見部位發生的滑膜肉瘤，檢測SYT-SSX融合基因很有意義，因為該種基因融合僅見于滑膜肉瘤。根據基因型分析和免疫組織化學結果可將浸潤性乳腺癌精確細分為激素受體陽性乳腺癌（ER、PR陽性表達），HER2陽性乳腺癌（HER2陽性、ER、PR陰性），三陰性乳腺癌（ER、PR、HER2均陰性）和三陽性乳腺癌（ER、PR、HER2均陽性），其生物學特性、臨床表現、治療方案選擇和預后截然不同，可見腫瘤基因分析在病理學診斷基礎上增加了預測和預后因素的解釋。胃腸道間質瘤（GIST）成為一個獨立疾病單位，是基因型分析與病理診斷相結合的里程碑。C-kit和PDGFRA基因突變及ckit(CD117)表達作為GIST明確的診斷指標和酪氨酸激酶抑制劑格列衛靶向治療的預測因子已成為共識。現今從基因型分析角度可將結直腸癌分為染色體不穩定性結直腸癌（占85%）和微衛星不穩定性結直腸癌（占15%）[7]。后者多見于右半結腸，癌細胞由分化稍差的二倍體細胞組成，產粘液，少轉移，預后稍好。在腫瘤發生早期檢測K-ras基因狀態有助于了解病情，結直腸癌、胰腺癌等腫瘤早期，患者癥狀不明顯，K-ras基因突變可作為高危因素，實現癌癥的早發現、早治療，以免錯過最佳治療時機。但其更重要的角色是預測針對EGFR突變的靶向藥物的療效[8]。

迅速發展的分子病理學診斷已經成為人們關注的熱點，靶向治療的基礎是靶向診斷，靶向診斷由病理醫師來完成。個體化醫學對病理學科來說既是挑戰，又是病理學發展的機遇，機會稍縱即逝，錯失良機將會給后代留下無法彌補的遺憾。

病理醫生在病理組織學診斷基礎上，通過基因型分析識別出疾病特有的基因異常（DNA）和生物標志物（mRNA），認識疾病的發生、發展規律。尤其惡性腫瘤還可預測其易感性、轉移潛能、靶向治療敏感性和耐藥性，并促進了許多新的分子診斷檢測項目的誕生，又能為臨床醫師和患者提供更多的治療相關信息。真正起到了醫師中的醫師作用。我們已然意識到分子病理學的發展趨勢，將以極大的熱忱投入到“分子時代”的激流之中，為之奮斗與傾力。因為分子病理是疾病診斷“金標準”中的“金標準”，它不僅能做出精確的疾病診斷，協助臨床醫師進行疾病預測、靶向治療和預后分析，還將為患者提供其一生的個體化疾病預防性建議。此外，病理科存儲的大量組織標本檔案資料和基因學信息還可為基礎醫學提供可觀的研究素材，為轉化醫學服務，如第三代測序中的單分子即時DNA測序和納米技術能直接讀取RNA序列或甲基化修飾的核酸序列而無需特異的PCR反應，使表觀遺傳學和后基因組研究如虎添翼?？梢灶A測基因型分析對于病理工作者已不再是錦上添花的基礎性研究，而是病理診斷不可或缺的實踐技術。所以加強分子病理檢查與診斷，提高病理診斷含金量至關重要。

總之，強調病理診斷是“金標準”，病理醫師是醫師中的醫師，反映了正確的病理診斷的重要性，醫療行政部門和醫院的各級領導應注重病理科的建設，同時也意味著病理工作的責任重大，只有各方共同努力才能不斷提高病理診斷“金標準”的含金量。

分子病理檢查是病理診斷的重要部分，代表了當代病理發展乃至醫學發展的趨勢。我國病理科如何根據個體化治療的需要，調整病理科的整體布局，是一個戰略性問題，我們強烈呼吁國家有關管理部門盡快制定分子病理學診斷與技術規范化與標準化專家共識意見和分子病理檢查的價格標準和醫保政策。

1 胥雪冬，董書.加強醫院病理科管理與質量控制的5點建議——1例臨床標本混淆引起的思考[J].中國醫院管理，2011,31(12):25-26

2 張品南，馮國飛，陳艷梅.腫瘤分子分型與靶向治療[J].醫學研究雜志，2009,38(6):9-11

3 來茂德.中國病理學發展的現狀和未來[J].中華病理學雜志，2012,41(1):1-3

4 陳曉霞，周彩存.分子病理檢測在非小細胞肺癌診療中的意義[J].中華病理學雜志，2012,41(8):570-572

5 張品南，馮國飛.臨床病理風險的防范與對策[J].醫院管理論壇，2012,29(8):15-19

6 孟剛.中國大陸病理行業發展存在的體制性問題及對策探討[J].臨床與實驗病理學雜志，2012,28(1)5-7

7 VilarE，Gruber SB.Microsatellite instability in colorectal cancer the stable evidence[J].Nat Rev Clin Oncol，2010,7(3):153-162

8 李占穩，劉玉琴.K-ras基因突變相關的腫瘤靶向治療進展[J].中華病理學雜志，2012,41(1):59-61