顆粒蛋白前體與類風濕關節炎的研究進展

陳佳喜 沈 波

一、TNF的簡介

TNF是一種具有廣泛生物學效應的細胞因子，按其存在狀態分2型:mTNF和 sTNF。膜結合 TNF(membrane-bound TNF，mTNF)即Ⅱ型跨膜蛋白TNF，在金屬蛋白酶水解作用下可變為可溶性TNF(soluble TNF，sTNF)。研究發現，mTNF與sTNF間存在巨大的生物學功能差異:sTNF是急慢性炎性反應過程中的促炎性因子;而mTNF在急慢性炎性反應過程中能抑制炎癥的激活，已有研究報道mTNF能抑制自身免疫性腦脊髓炎、慢性關節炎等自身免疫性疾病[1，2]。

sTNF是一種具有廣泛生物學效應的細胞因子，按其結構分為2型:TNF-α和TNF-β。TNF中發揮主要生物學活性的是腫瘤壞死因子-α(tumor necrosisfactor-alpha，TNF-α)，主要由單核 -吞噬細胞分泌，其他如淋巴細胞、平滑肌細胞、成纖維細胞等在一定條件下也具有產生和釋放TNF-α的能力。而腫瘤壞死因子 -β(tumor necrosisfactor-alpha，TNF-β)主要由活化的自然殺傷細胞和T淋巴細胞產生。TNF-α是一種促炎性細胞因子，主要調節細胞增殖和細胞凋亡，有細胞毒和細胞溶解作用，并與其他細胞因子一起形成復雜的免疫網絡影響細胞的生長分化。

二、TNFR的簡介

TNF-α通過細胞膜上的腫瘤壞死因子受體(tumor necrosis factor receptor，TNFR)發揮生物學活性，TNFR按相對分子質量分為兩類，TNFR1(CD120a)和TNFR2(CD120b)。它們的胞外區都含有4個富含半胱氨酸的結構域(cysteine-rich-domain，CRD)，每個CRD由6個半胱氨酸組成，形成3對二硫鍵，CRD獨特的結構決定TNF-α與TNFR之間的特異性結合，與TNF-α結合部位是CRD2和CRD3。TNFR1和TNFR2與各自配體結合，激活特異信號通路，參與不同的效應。一般來說，TNFR1表達很廣泛，主要促進炎性反應[3]。而TNFR2主要表達在淋巴細胞上，能刺激淋巴細胞的激活，此外它還能抑制Treg細胞的激活及其免疫抑制功能[4]。

三、TNF-TNFR信號通路簡介

TNFR1主要激活強烈的NF-κB信號通路從而介導胞內死亡區域有效激活caspases通路，而TNFR2與TNFR1轉導的信號通路相反:TNFR2缺乏死亡區域，只能通過經典或非經典的NF-κB信號通路激活細胞保護功能，抑制壞死通路介導細胞的死亡[5]。因此，TNFR2能抑制 TNFR1介導的促炎性反應，在不同疾病動物模型中發揮神經保護、組織修復功能[6]。

TNFR2在抗原激活、增生、生存中均發揮中要作用。最近，TNFR2信號通路還被證明能選擇性促進Treg細胞增生及其細胞功能的發揮[7]。mTNF致耐受性作用也被歸納為是通過TNFR2發揮。因此，免疫反應中TNFR1與TNFR2介導不同的重要信號通路提示可通過靶向抗TNF-α治療。

四、PGRN的生物學效應

近年來研究發現，顆粒蛋白前體(progranulin，PGRN)就能與TNFR2強烈結合，在類風濕關節炎的治療過程中起著重要的作用[8]。人PGRN蛋白由染色體17q21上 PGRN基因編碼，相對分子質量為88kDa，含有7個半富含絲氨酸的串聯重復序列結構域(CX5-6CX5CC X8CCX6CCXDX2HCCPX4CX5-6C)，該前體被蛋白酶水解后，生成7.5個高度保守、具有生物學活性的多肽片段，稱為顆粒蛋白[9]。目前，PGRN生物學效應主要歸于促發育生長的作用和炎癥調控作用兩個方面。

1.促發育生長的作用:PGRN能夠調節健康組織的生長、維持、修復。在損傷的皮膚組織中，PGRN直接作用于成纖維細胞和上皮細胞，增加中性粒細胞、巨噬細胞的聚集，促進血管內皮細胞和成纖維細胞的增生、分化和遷移，形成新生血管，加速傷口愈合。而在未損傷的組織中，成纖維細胞和內皮細胞中均檢測不到 PGRN[10]。PGRN還參與腫瘤的形成和增生。遺傳性PGRN缺陷會導致癡呆和膠質母細胞瘤等神經系統腫瘤，但PGRN增多也會導致腫瘤的發生，如在乳腺癌、腎細胞癌、膀胱癌等多種惡性腫瘤患者外周血液中均發現PGRN的高水平表達，且可作為預測腫瘤復發、觀察療效的生物標志物[11～14]。

2.炎癥調控作用:PGRN具有重要的抗炎作用，是TNF-α的潛在抑制劑。在動脈粥樣硬化患者頸動脈內膜平滑肌細胞標本中存在PGRN表達，提示PGRN參與動脈粥樣硬化形成這一慢性炎癥過程，過表達PGRN或加入外源性重組PGRN均可減少平滑肌細胞IL-8的分泌，而PGRN基因敲除的細胞中IL-8水平明顯上升[15]。PGRN在控制自身免疫性疾病如類風濕關節炎的進程中也起到關鍵作用。已發現局部注射重組PGRN可使多種關節炎模型小鼠體內中性粒細胞炎性反應被抑制，提示PGRN是重要的炎性抑制因子。而且PGRN在關節炎性動物模型中可與TNF受體選擇性結合并抑制下游炎性通路信號，顯示出良好的抗炎治療效果[8]。最新多項臨床研究發現，類風濕關節炎、系統性紅斑狼瘡等自身免疫性疾病的患者血清PGRN水平明顯高于正常人群，其高表達的機制可能提示機體慢性炎癥、免疫紊亂狀態[16～19]。

五、PGRN與TNFR2結合可抑制TNF-α的作用

鑒定PGRN與TNFR2特異性結合拮抗TNF-α信號可深入了解PGRN的作用及其作用機制，可為類風濕關節炎等由TNF-α信號介導的疾病提供更好的治療方案。

通過全基因掃描后發現TNFR2確實是PGRN特異性受體[8]。TNF- α、PGRN 均可與 TNFR1、TNFR2結合，但 TNF-α與 TNFR1有更高的親和力，而PGRN與TNFR2有更高的親和力。因此PGRN可通過干擾TNF-α與TNFR受體結合拮抗TNF-α的信號通路。已報道，加入PGRN能抑制TNF-α介導的嗜中性粒細胞的激活、軟骨的降解。而且去除PGRN能顯著增加嗜中性粒細胞釋放H2O2，及骨髓來源的巨噬細胞釋放NO，加劇TNF-α介導的軟骨的破壞。

六、PGRN與類風濕關節炎的研究進展

為深入了解PGRN在類風濕關節炎小鼠體內的作用，實驗將小鼠體內PGRN基因敲除，發現PGRN-/-缺陷小鼠在Ⅱ型膠原誘導后能引發更嚴重的關節炎，表現為100%的發生率，炎癥得分比PGRN基因不敲除的同種小鼠更高，骨、關節的破壞也更嚴重，而應用重組的PGRN后能完全逆轉疾病的進展[8]。提示體內PGRN表達缺失將更容易誘發關節炎，但可運用重組的PGRN逆轉。

為深入了解PGRN體內抗炎作用是否通過抑制TNF-α信號介導，發現TNF轉基因小鼠去除PGRN基因后將自發關節炎、去除PGRN基因后顯著加重已發的關節炎。雖然TNF轉基因小鼠能自發輕度癥狀的類風濕關節炎，但相對TNF-Tg PGRN+/+12周齡的小鼠，TNF-Tg/PGRN-/-和TNF-Tg/PGRN+/-小鼠關節腫脹畸形嚴重影響活動(其滑膜炎癥、血管翳形成、關節破壞、軟骨基質破壞明顯)。用重組的PGRN治療TNF-Tg小鼠能消除肉眼可見的關節炎和顯著降低炎癥得分，而停用重組的PGRN治療7天后又發展出肉眼可見的炎癥及增加炎癥得分[8]。

雖然PGRN有強烈的抗炎作用，但多種不良反應限制了它在臨床的直接運用，如強致癌阻礙它的臨床應用。因此研究人員設計了一種新型蛋白-拮抗TNFR受體抑制TNF/TNFR信號通路(antagonist of TNF/TNFR signaling via targeting to TNF receptors，Atsttrin)，簡稱為Atsttrin。這種蛋白由3個PGRN片段組成，具有選擇性的TNFR結合特性，之后他們利用Atsttrin和PGRN分別進行動物實驗，結果發現Atsttrin具有更強的抑制關節炎的活性。并且Atsttrin有更少的不良反應。事實已證明，運用高劑量的Atsttrin對橫紋肌肉瘤細胞株A673/6幾乎沒有細胞毒作用，而DBA1/J小鼠每天注射高劑量的Atsttrin，對其心、肺、胃、脾、胰腺、小腸、結腸均未觀察到不良反應。

PGRN與TNF都是TNFR的配體，兩者存在競爭關系，它們之間的平衡能更好地解釋炎癥及腫瘤間的關系，例如TNF活性增加會增加RA等自身免疫性疾病的發生。反之，PGRN活性增加會增加細胞的過度增生甚至導致腫瘤的發生。現如今的TNF抑制劑大多與TNF結合，從而抑制TNF介導的炎性發生。但此治療過程必定會增強PGRN與TNFR的結合，而增強的PGRN活性將導致細胞的過度增生，最終可導致腫瘤的發生。而Atsttrin能直接與TNFR結合，既能抑制TNF的作用，降低RA等自身免疫性疾病的發生，也能抑制PGRN的作用，降低細胞的過度增生甚至抑制腫瘤的發生[20]。

七、PGRN激活TNFR2信號通路

越來越多的研究已證實PGRN與Atsttrin通過TNFR2信號通路保護RA關節侵蝕的機制:①可通過拮抗TNF-α抑制炎性反應，已證實PGRN與TNFR2的結合能力是TNF-α的600倍，因此PGRN與TNFR2的結合后可抑制炎癥的進展[20];②可通過刺激Treg細胞分化，已證實PGRN能促使原始細胞向Treg細胞分化;③可通過TNFR2信號通路調節Treg細胞功能，因為Treg細胞只能表達TNFR2，而不能表達TNFR1，因此能預防多種自身免疫性疾病，而且PGRN能保護Treg細胞免受TNF-α介導的炎性反應[7]。

八、展 望

PGRN是具有多種生物學效應的內源性蛋白，同時也是TNFR2的一種配體，可作為TNF-α信號途徑的拮抗劑，從而擾亂TNF-α/TNFR1相互作用。已證明PGRN在小鼠炎癥關節炎的病理發生過程中扮演了重要的角色。發明的Atsttrin作為PGRN的衍生物，不良反應更少，且能更強地抑制RA的發病及炎癥進展。因為很多疾病都涉及TNF/TNFR信號通路，因此，拮抗此信號通路將能治療多種疾病，但目前針對PGRN的信號轉導機制仍不完全清楚，對其細胞信號通路的深入研究，可架起連接二者的橋梁，加深對類風濕關節炎發病機制的理解，將成為今后相關疾病的早期診斷和治療提供科學依據。

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