線粒體參與糖尿病腎病發生的研究新進展

孫 悅(綜述)，甘 華(審校)

(重慶醫科大學附屬第一醫院腎臟內科，重慶 400016)

糖尿病腎病(diabetic nephropathy，DN)為糖尿病累及微血管主要并發癥之一，是終末期腎病重要死亡原因。盡管采取多種臨床策略治療糖尿病及防范其并發癥，至少1/3患者腎功能仍逐漸降低至終末期。DN的進展性、不可逆性、高發病及高致死率等特點備受研究者關注[1]，研究發現線粒體具備調節細胞增殖或凋亡、維持細胞內鈣穩態能力。線粒體可通過加劇炎癥浸潤、血管纖維化促進糖尿病腎損害：①高糖環境誘導線粒體DNA(mitochondrial DNA，mtDNA)聚集，激活Toll樣炎癥信號通路；②解偶聯蛋白2、線粒體抗病毒信號分子失衡，誘導活性氧類等物質表達；③線粒體鈣離子單向轉運蛋白(mitochondrial calcium uniporter，MCU)和線粒體鈣離子攝取蛋白1(mitochondrial calcium uptake 1，MICU1)異常致線粒體Ca2+生理失穩態。

1 DN與線粒體DNA

真核生物線粒體具有較獨立的母系遺傳體系。人的mtDNA基因組長16 569 bp，編碼37種蛋白，其中13種蛋白是呼吸鏈的主力軍。其DNA呈雙環結構，具非甲基化CpG模體，類似原核質粒[2]。故此機體免疫系統會“錯認”，mtDNA CpG結構為外來致病因素，從而激發炎性介質釋放。Barbalat等[3]和Sparwasser等[4]先后發現mtDNA可直接通過Toll樣受體9致炎。注射了氧化mtDNA的小鼠會患上關節炎，且檢測血中細胞比例情況，免疫細胞的升高以單核細胞為主[5]。腫瘤患者化療后，外周血mtDNA水平顯著增高，同時發現mtDNA可直接激動Toll樣受體9，激活中性粒細胞趨化浸潤[6]。更為有力的小鼠體內實驗證明，心肌細胞胞液中mtDNA積聚，可誘發小鼠心力衰竭，剔除編碼溶酶體DnaseⅡ基因(編碼Dnase 2a，為溶酶體降解mtDNA的重要成分)或者注射Toll樣受體9的選擇性激活劑后，干預組小鼠死亡率顯著高于對照組；實驗者解剖兩組小鼠心臟發現，干預組小鼠左心室擴張，鏡下觀察心肌細胞中CD68+巨噬細胞及淋巴細胞抗原6G細胞浸潤程度嚴重，且Ⅱ型膠原、白細胞介素6、干擾素α等纖維化及炎性因子表達水平顯著高于對照組[7]。上述資料顯示，線粒體不單純是供能細胞器，其還具有潛在致炎能力。另有報道，對DN小鼠的腎組織進行染色發現，發生腎損害小鼠腎小管上皮細胞內的線粒體數量多于對照組[8]。Malik等[9]發現,DN患者外周血細胞mtDNA拷貝數水平較正常組、糖尿病非腎病組顯著增高，提示線粒體在DN致病機制中扮演重要角色，這可能與病理狀態下線粒體受損裂變有關。正常生理活動下，各細胞有相對恒定的線粒體密度，受損的線粒體可通過自噬作用被清除。然而，當機體遭受炎癥、缺血缺氧等打擊處于應激狀態時，活性氧類大量生成，線粒體受損開始發生分裂，造成細胞內大量線粒體積聚。同時，由于mtDNA與活性氧類生成場所相近，導致其相互作用密切，mtDNA突變、裂解增加，通過Toll樣受體放大炎癥效應[10]。

2 DN與線粒體調節通路

2.1解偶聯蛋白2 解偶聯蛋白2(uncoupling protein-2，UCP-2)是一類線粒體內膜載體，在人體多處組織表達，如脂肪、胰島及腎臟。其參與形成內膜兩側質子漏，控制呼吸鏈質子轉運，抑制葡萄糖轉換腺苷三磷酸(adenosine triphosphate，ATP)，降低胰島素抵抗。除此之外，UCP-2作為氧化還原保護蛋白，通過降低活性氧類減輕氧化應激損傷。UCP-2與生物體能量代謝密切相關，這一特點決定了其在代謝性疾病，尤其在糖尿病研究中的重要地位。

有文獻報道，UCP-2通過抗氧化作用改善高血糖誘導的內皮細胞功能紊亂，延緩糖尿病微血管病變的發生[11]。Qiu等[12]發現，與正常小鼠相比，糖基化終產物受體基因缺陷糖尿病小鼠的腎小球濾過率降低，蛋白尿增多，而UCP-2基因的表達上調，線粒體超氧化物歧化酶生成減少。另外，研究者發現UCP-2基因剔除DN小鼠模型的近曲小管細胞內，線粒體ATP解偶聯作用被腺苷酸轉運蛋白通路替代，線粒體膜電位降低、超氧化物生成增多，加重了糖尿病腎臟損害，提示UCP-2通路在機體高糖狀態下可增加細胞應激耐受力，代償器官功能[13]。然而，UCP-2高表達又可增加細胞耗氧量，使器官處于慢性相對低氧低能狀態，推動腎功能逐步轉入失代償狀態，屆時加重腎臟損害惡化[14-15]。UCP-2是一把雙刃劍，其在DN的中作用需更多的科學實驗進一步探索。

2.2線粒體抗病毒信號分子 線粒體抗病毒信號分子又被稱為干擾素β啟動刺激因子1、人病毒誘導適配蛋白，是一種線粒體調節蛋白。識別受體視黃酸誘導基因蛋白I和黑色素瘤異化相關基因5與病毒特定RNA區域結合后，改變自身構象，暴露C末端的胱冬肽酶募集結構域段與線粒體抗病毒信號蛋白相連接，從而通過核因子κB激酶抑制劑/腫瘤壞死因子受體相關因子家族成員相關的核因子κB活化劑結合激酶1通路途徑，激活核因子κB和干擾素調節因子3，誘導生成干擾素I及其他抗病毒分子[16-18]。此機制區別于核內體Toll樣受體途徑，介導細胞液中抗病毒作用。

糖尿病是內分泌紊亂相關的代謝性疾病，但有文獻報道，其與慢性炎癥狀態、免疫失衡有關。Stene等[19]發現，病毒感染與1型糖尿病發病的相關性，1型糖尿病患者血中病毒抗體水平與病情嚴重程度呈正比，而使用胰島細胞高親和性病毒(如柯薩奇病毒、腦心肌炎病毒)感染小鼠后，胰島β細胞因自傷免疫機制凋亡，血糖短期內升高，達到糖尿病診斷標準，該實驗成功模擬了1型糖尿病臨床及病理改變。另有流行病學調查表明，慢性病毒性肝炎患者罹患2型糖尿病的概率明顯增高[20]。上述信息提示，病毒感染可參與糖尿病的發生、發展。

既往文獻報道，病毒直接感染腎小球上皮細胞，并不會出現相應臨床腎炎病理活檢樣改變。干擾素I雖然能有效抗病毒，但近幾年研究發現，病毒相關性免疫激活后大量釋放的干擾素I可誘發足細胞凋亡、系膜細胞增殖、蛋白尿增加、腎功能損害加劇，可作為腎損害獨立危險因素，而檢測糖尿病患者或糖尿病小鼠模型的外周血，均有線粒體抗病毒信號蛋白及干擾素I反應性高表達[21-22]。該現象可能與糖尿病導致免疫力低下、病毒感染率增高有關，在反復感染過程中，加重腎臟損害。

3 MCU和MICU1

迄今為止，已有大量文獻證實線粒體功能紊亂可引起慢性微炎癥狀態、基質降解及血管內皮的纖維化，而發生機制均有Ca2+通道的異常調控的參與[23-24]。目前已將線粒體Ca2+通道的調節異常與多種疾病相互聯系，如心肌炎癥浸潤及心力衰竭越重，線粒體Ca2+水平越高；線粒體Ca2+水平與胰島β細胞分泌胰島素程度一致；給予線粒體Ca2+離子通路特異性阻斷劑后，細胞活性氧類生成水平下降，核因子κB、白細胞介素10等前炎性介質的釋放也隨之下調[25]。線粒體Ca2+水平增高，是胞液Ca2+大量涌入引發的結果。而Ca2+細胞外液流動與調控活性氧類生成有關，目前考慮以下幾種機制：①Ca2+通過推動三羧酸循環，加快電子在傳遞鏈中的交換速度；②Ca2+可激活一氧化氮合酶活性，上調一氧化氮水平，抑制呼吸鏈中復合體Ⅳ活性，增加活性氧類含量；③Ca2+與心磷脂結合；④活性氧類大量積聚以及細胞鈣調節紊亂的出現，加劇細胞壞死，導致機體損傷與修復并行，加重DN血管病變。

DN病理改變主要為慢性進展性微血管硬化，早期為腎小球毛細血管基膜增厚、系膜區基質沉積，出現毛細管襻折疊及融合，阻塞毛細血管；而病情進展到晚期，腎小球逐漸透明樣變并硬化形成，其特征性病理改變為結節性腎小球硬化。有文獻表明，線粒體Ca2+水平增高與糖尿病所致蛋白尿、微血管纖維化程度呈正比關系，而予以鈣通道抑制劑后微量蛋白尿可基本消失，即提出早期使用藥物臨床干預可減輕甚至逆轉糖尿病腎損害[26]。

20世紀60年代，一種單向運輸體在小鼠腎細胞內被發現，并被確認為線粒體攝取Ca2+主要環節，該過程并不需要ATP功能，不伴隨其他離子或分子共運輸，與曾鑒定的亮氨酸拉鏈“EF”手形結構域跨膜蛋白1、線粒體鈉-鈣交換體特性不同[27]。Perocchi等[32]新發現的一種與線粒體攝取鈣有關的特殊蛋白，符合這種單向運輸體特點，將其命名為MICU1，又名CBARA1(calcium binding atopy-related autoantigen 1)，為困擾科學界數十年關于線粒體鈣調控的問題提供了重要思路。前期序列分析發現MICU1的N端有單跨膜結構域及兩個經典”EF”手形結構,因此其被認為參與線粒體Ca2+攝取及對細胞質鈣離子升高緩沖過程，不影響線粒體呼吸過程及膜電位。后期研究提出，MICU1主要起著“看門人”的作用，通過感知線粒體基質中的鈣濃度調節MCU活性，控制Ca2+攝取[28]。MCU是MICU1相對應的線粒體鈣單運輸體，同樣參與線粒體Ca2+攝入活動[29]。Chaudhuri等[30]應用電壓鉗技術，精確測量HEK-293T細胞株細胞內外的鈣離子流動，發現MCU基因剔除或使用選擇性抑制劑釕紅，單向運輸通道向線粒體內泵入鈣離子的數目明顯減少。這兩種蛋白相輔相成，共同調控線粒體Ca2+流通。

Perocchi等[32]進一步明確了MICU1及MCU功能對細胞造成的影響，發現MICU1可維持正常環境下細胞內線粒體的鈣攝取水平；一旦MICU1失活，線粒體會出現Ca2+超載，生成過量的活性氧類、阻斷ATP生成，并激活AMP激酶介導的自噬系統，最終導致細胞死亡。目前已證實，這兩個分子之間平衡的破壞將會導致神經元、心臟細胞、肝臟和其他器官受損[30-32]。雖然MCU、MICU1在DN中的研究尚未見報道，但其發生機制與糖尿病發生密切相關。這兩種蛋白被測定在體外腎細胞表達、且可影響腎細胞功能，其可通過影響線粒體Ca2+水平促進糖尿病腎損害。

4 小 結

近年來線粒體結構及功能紊亂在DN致病機制中所起的作用備受關注，對其機制的研究也取得了一定進展。本文就相關資料中較新研究成果，如mtDNA致炎、線粒體蛋白通路異常、MCU和MICU1致鈣紊亂失衡等方面進行綜述。由此可見，線粒體在DN發生、發展過程中起著至關重要的作用。但以上各環節之間的相互聯系尚不夠緊密，有待進一步實驗及探討。闡明這些機制及其聯系可能為早期阻斷由線粒體受損引發的炎癥過度釋放或蛋白異常表達、改善DN預后提供新的臨床治療思路。

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