4-羥基異亮氨酸的研究現狀*

高峰,蔡琴,蔡倫,盧芙蓉

(1.華中科技大學同濟醫學院附屬協和醫院內分泌科,武漢 430022;2.武漢市中心醫院神經外科,武漢430014;3.華中科技大學同濟醫學院附屬協和醫院中西醫結合科,武漢 430022)

·特約稿·

4-羥基異亮氨酸的研究現狀*

高峰1,蔡琴1,蔡倫2,盧芙蓉3

(1.華中科技大學同濟醫學院附屬協和醫院內分泌科,武漢 430022;2.武漢市中心醫院神經外科,武漢430014;3.華中科技大學同濟醫學院附屬協和醫院中西醫結合科,武漢 430022)

4-羥基異亮氨酸是從葫蘆巴種子中提取的活性成分,其藥理作用較為廣泛,主要包括降血糖、降血脂、改善胰島素抵抗等,因而作為傳統中藥成分被用于治療2型糖尿病、血脂異常、代謝綜合征以及脂肪肝等疾病。該文就4-羥基異亮氨酸的研究現狀及應用前景進行綜述。

4-羥基異亮氨酸;胰島素分泌;胰島素抵抗;血脂紊亂

隨著社會經濟發展和生活方式的改變,我國疾病譜也發生顯著變化,一些慢性非傳染性疾病,例如高血壓、動脈粥樣硬化、冠心病、糖尿病、血脂異常、肥胖癥的患病率正逐漸上升[1]。同時針對治療這些疾病的藥物也成為近年研究熱點,尤其是傳統中藥成分。葫蘆巴是草本植物,很久以前就已被當作調味品、蔬菜、治療藥物來使用[2]。作為古老的傳統中藥,葫蘆巴的藥理作用非常廣泛,除了熟知的降血糖、降血脂活性,兼有抗炎、抗氧化、抗腫瘤、減輕體質量、治療脂肪肝和慢性腎衰竭等作用[3-4]。1973年,FOWDEN等[5]首次從葫蘆巴中分離提取出其活性成分,一種非蛋白氨基酸即4-羥基異亮氨酸(4-hydroxyisoleucine,4-HIL),隨后BROCA等[6]報道4-HIL包括兩種非對映異構體,主要成分(2S,3R,4S)-異構體約占90%,次要成分構型為(2R,3R,4S)-異構體。筆者主要就4-HIL的提取分離、合成、藥理作用以及臨床應用前景進行相關探討。

1 4-HIL的提取及分離

1973年,FOWDEN運用一系列方法從14 kg葫蘆巴種子中分離得到(2S,3R,4S)-4-HIL 7 g。首先, 20%乙醇處理葫蘆巴種子,重復提取3次;隨后, Zeokarb225柱以及氨水分離洗脫,產物真空濃縮;濃縮部分進一步應用Dowex50×8柱和氨水分離洗脫;濃縮結晶后將其鹽酸化,90℃加熱10 min后再次利用Dowex50柱和水持續洗脫,最終收獲(2S,3R,4S)-4-HIL[5]。

1984年,SAUVAIR等采用不同的方法從葫蘆巴種子中也提取到4-HIL。該小組首先將葫蘆巴種子磨成粉末狀,再用70%乙醇提取6次后真空濃縮;隨后利用Amberlite IR 120 H+型以及氨水分離洗脫氨基酸混合物;產物冷凍干燥后用硅60柱洗脫及分離;最后經純化結晶得到4-HIL[7]。

以上兩種提取分離4-HIL的途徑,后者比前者提取率稍高,但總的來說,過程較為復雜,效率都很低。因此,近年來學者們更關注的是4-HIL的合成。

2 4-HIL的合成

2002年,WANG等[8]發明八步化學-酶合成法合成4-HIL。該方法首先以2-甲基乙酰乙酸乙酯為原料,在地霉菌的作用下得到(2S,3S)-3-羥基-2-甲基丁酸乙酯,再經過7個步驟轉變成(2S,3R,4S)-4-HIL。其中,最關鍵的步驟為第一步,即(2S,3S)-3-羥基-2-甲基丁酸乙酯的生成。

2004年,FULCRAND等[9]提出六步化學-酶合成法合成4-HIL。第一步以溴乙酸叔丁酯為底物,在二芐胺的催化下得到二-N-苯甲基甘氨酸叔丁酯,經過開環、色層分析等分離得到外消旋4-HIL內酯,最后在青霉素?；D移酶作用下水解N-苯乙酰內酯衍生物得到(2S,3R,4S)-4-HIL。

2007年,簡化的體外兩步合成4-HIL途徑由SMIRNOV等[10]報道。該方法分為兩個步驟,第一步為醛縮反應,乙醛和α-酮丁酸由特殊的醛縮酶(4-hydroxy-3-methyl-2-keto-pentanoate aldolase,HPAL)催化,形成4-羥基-3-甲基-2-酮戊酸鹽(4-hydroxy-3-methyl-2-keto-pentanoate,HMKP);第二步是4-羥基-3-甲基-2-酮戊酸鹽和L-谷氨酸鹽在支鏈氨基酸轉氨酶作用下氨基化形成(2S,3R,4S)-4-HIL。

2009年,KODERA等[11]為了追求更有效率的4-HIL合成方法,認為最有效的方法是最大程度地發揮L-異亮氨酸羥基化活性,而具有這種酶活性的只有L-異亮氨酸雙加氧酶(L-isoleusine dioxygenase,IDO),于是首次提出利用蘇云金芽孢桿菌菌株2e2在對數生長期產生IDO將L-異亮氨酸轉變為(2S,3R,4S)-4-HIL,從而提高4-HIL的產率。作者希望該方法對工業化大量生產4-HIL提供有效途徑。

2010年,SMIRNOV總結4-HIL合成方法的歷史發展過程,再次提出關于合成4-HIL全新的思路。他提出利用大腸埃希菌產生IDO,繼而在IDO催化下以L-亮氨酸和α-酮戊酸鹽為原料產生4-HIL和琥珀酸鹽,首次將4-HIL的生成與三羧酸循環聯系起來。

縱觀4-HIL合成方法的發展過程,值得一提的是合成法越來越簡化,而4-HIL的產率越來越高,這樣低成本、高效率的生產4-HIL更值得期待。

3 4-HIL的藥理作用

3.1 促進胰島素分泌作用 1999年BROCA等[12]首次報道4-HIL具有促胰島素分泌作用。實驗由以下幾個部分構成:對Wistar大鼠行靜脈注射葡萄糖耐量實驗(intravenous glucose tolerance test,IVGTT),輸注葡萄糖0.5 g·kg-1的同時加或不加4-HIL,實驗前后不同時間點監測胰島素和血糖水平;對正常狗行口服葡萄糖耐量實驗(oral glucose tolerance test,OGTT),實驗前給予或不給予胃內輸注4-HIL(18 mg·kg-1),實驗前后不同時間點監測胰島素和血糖水平;糖尿病模型大鼠以50 mg·kg-1的劑量給予4-HIL連續治療6 d后檢測血糖及胰島素水平;用4-HIL 200 μmol·L-1灌注不同濃度葡萄糖孵育的糖尿病模型鼠游離胰島,并監測胰島素水平。通過以上實驗,結果顯示4-HIL可直接作用于胰島β細胞促進胰島素分泌,血糖越高(8.3～16.7 mmol·L-1)作用越強。2000年,該小組進一步研究4-HIL的幾種異構體及其內酯對胰島素分泌的影響,他們用不同的制劑灌注體外胰腺(血糖為8.3 mmol·L-1),結果證實在濃度相同(200 μmol·L-1)的情況下(2S,3R,4S)-4-HIL促胰島素分泌作用最強,其余兩種異構體幾乎無作用[13]。

3.2 改善胰島素抵抗 胰島素抵抗包括中樞性胰島素抵抗和外周組織胰島素抵抗,目前研究較多的是4-HIL對外周組織胰島素抵抗的影響以及機制。2004年,BROCA等[14]首次報道4-HIL不僅能促進胰島素分泌,而且具有改善胰島素抵抗的作用。該小組利用金標準實驗方法正葡萄糖高胰島素鉗夾實驗,檢測高糖高脂飲食的斯潑累格·多雷(Sprague Dawley,SD)大鼠和Zucker fa/fa鼠的相關指標,結果顯示4-HIL通過激活IRS-1相關的PI3K通路促進周圍組織對葡萄糖的攝取利用,并減少肝臟葡萄糖輸出以改善外周性胰島素抵抗。

2005年,RUBY等[15]設計一項活體實驗,該研究觀察男性騎車者運動后4-HIL對肌肉糖原含量的影響。在該實驗設計中,受試者禁食12 h,騎車90 min耗盡肌糖原后行股外側肌活檢,活檢完及2 h后按體質量給予口服右旋葡萄糖或者口服含4-HIL的右旋葡萄糖;騎車后4 h內檢測肌糖原含量。結果顯示4-HIL可促進肌糖原的合成。2012年,JAISWAL用4-HIL作用于大鼠骨骼肌細胞(L6-Glut4myc),結果提示細胞肌小管對2-脫氧-[3H]-葡萄糖的攝取率明顯升高,Glut4以及Glut1總表達量無明顯變化,但向細胞膜轉移的Glut4增多了;另外,4-HIL顯著增加磷酸化AKT(Ser-473)的表達量。兩項研究均證實4-HIL具有改善肌肉組織胰島素抵抗的作用。

本小組的前期實驗研究4-HIL對小鼠3T3-L1脂肪細胞和HepG2細胞腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)轉化酶(TACE)-基質金屬蛋白酶組織抑制因子-3(tissue inhibitor of metalloproteinases-3, TIMP-3)-TNF-α系統的影響。研究發現,4-HIL通過抑制TACE,增強TIMP-3表達來減少TNF-α的生成,進而抑制IRS-1(Ser307)的磷酸化,促進Glut4的表達[16]。因此,筆者認為4-HIL可改善肝臟以及脂肪組織的胰島素抵抗。

3.3 調脂作用 1990年,SHARMA等[17]首次報道葫蘆巴種子的降血脂作用。隨后,一項動物實驗證實葫蘆巴種子的活性成分4-HIL也保留降血脂作用。該研究利用高脂飲食建立血脂異常的倉鼠模型,口服4-HIL 50 mg·kg-1,治療持續1周。結果顯示三酰甘油(triglycerides,TG)下降33%,總膽固醇(total cholesterol,TC)下降22%,甘油和游離脂肪酸(free fatty acid,FFA)濃度下降,但高密度脂蛋白膽固醇(high density lipoprotein cholesterol,HDL-C)升高[18]。

2010年,SINGH小組給予具有2型糖尿病典型特征的C57BL/KsJ-db/db小鼠灌胃4-HIL 50 mg·kg-1·d-1,連續治療10 d,實驗期間檢測血糖、血漿胰島素、TG、TC、低密度脂蛋白膽固醇(low density lipoprotein cholesterol,LDL-C)、HDL-C。結果顯示血糖、血漿胰島素、TG、TC、LDL-C顯著降低,HDL-C升高[19]。

2012年,HAERI等[20]研究4-HIL對1型糖尿病(T1DM)模型鼠的血糖和血脂的影響。該實驗通過注射鏈脲霉素建立T1DM模型,建模后給予4-HIL 50 mg·kg-1·d-1連續干預4周。4周后,血糖、TG、LDL-C、TC、尿酸下降,而HDL-C升高。

4 4-HIL的臨床應用前景

4-HIL與西藥成分的顯著區別在于,中藥成分的副作用少。眾所周知,目前治療糖尿病的一線藥物都是西藥,但其副作用有低血糖、體質量增加、消化道反應、肝腎損害等。倘若將4-HIL應用于臨床治療糖尿病、血脂異常、代謝綜合征,在達到同樣的治療目標情況下,其治療后的副作用將會明顯減少或減輕,甚至忽略不計,故值得進一步的開發、研究。

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DOI 10.3870/yydb.2014.10.001

Research Update on 4-Hydroxyisoleucine

GAO Feng1,CAI Qin1,CAI Lun2,LU Fu-rong3
(1.Department of Endocrinology,Union Hospital,Tongji Medical College,Huazhong University of Science and Technology,Wuhan 430022,China;2.Department of Neurosurgery, Wuhan Central Hospital,Wuhan 430014,China;3.Department of Integrated Chinese Traditional and Western Medicine,Union Hospital,Tongji Medical College,Huazhong University of Science and Technology,Wuhan 430022,China)

Objective4-Hydroxyisoleucine(4-HIL)is the active component isolated from the seeds of Trigonella foenum-graecum.It exerts broad pharmacological effects such as anti-hyperglycemia,blood lipid lowing,improvement of insulin resistance,etc.As the Chinese traditional medicine,it can be used clinically in treating many diseases such as type 2 diabetes mellitus,dyslipidemia,metabolic syndrome,fatty liver and other diseases.Here the current research status and application prospect on 4-Hydroxyisoleucine were summarized.

4-Hydroxyisoleucine;Insulin secretion;Insulin resistance;Dyslipidemia

R284.2;R977.15

A

1004-0781(2014)10-1261-04

2014-04-20

2014-06-15

*國家自然科學基金資助項目(81001670)

高峰(1962-),男,湖北武漢人,教授,主任醫師,博士,主要從事糖尿病基礎與臨床的研究。電話:027-85726799,E-mail:gaofengwh@aliyun.com。

盧芙蓉(1979-),女,湖北武漢人,主治醫師,講師,博士,主要從事糖尿病中西醫結合基礎與臨床研究。電話: 027-85873071,E-mail:furonglulove@163.com。