芹菜素對血小板源生長因子誘導血管平滑肌細胞遷移的影響*

關紅菁,崔昌萍,黃際友,淑芬

(1.武漢大學人民醫院心血管內科,武漢 430060;2.武漢大學心血管病研究所,武漢 430060;3.解放軍75240部隊衛生隊,潮州 521000)

·藥物研究·

芹菜素對血小板源生長因子誘導血管平滑肌細胞遷移的影響*

關紅菁1,2,崔昌萍1,2,黃際友3,淑芬1,2

(1.武漢大學人民醫院心血管內科,武漢 430060;2.武漢大學心血管病研究所,武漢 430060;3.解放軍75240部隊衛生隊,潮州 521000)

目的 研究芹菜素在體外對血小板源生長因子(PDGF)誘導的血管平滑肌細胞(VSMC)遷移作用的影響及可能的分子機制。方法酶消化法獲取大鼠胸主動脈原代血管平滑肌細胞,Transwell小室方法評價芹菜素對PDGFBB誘導的VSMC遷移作用,Western blot方法檢測c-Jun N末端激酶(JNK)磷酸化水平。結果20 ng·mL-1PDGF-BB顯著促進VSMC遷移,細胞數達到對照組的2.46倍,而12.5 μmol·L-1芹菜素預處理遷移細胞數僅為PDGF-BB組46.5%,不同劑量的芹菜素均能顯著抑制PDGF-BB誘導的VSMC遷移,12.5 μmol·L-1芹菜素預處理顯著抑制PDGF-BB對JNK磷酸化。結論芹菜素對PDGF-BB誘導的VSMC遷移有顯著的抑制作用,其機制可能部分與抑制JNK活化有關。

芹菜素;血小板源生長因子;血管平滑肌細胞;細胞運動

動脈粥樣硬化是多種心腦血管疾病的基礎病變。經皮冠狀動脈介入術(percutaneouscoronary intervention,PCI)的發展,極大改善動脈粥樣硬化導致的血管阻塞,然而管腔內再狹窄是阻礙這項技術獲得長期成功的主要因素,血管平滑肌細胞(vascular smooth muscle cell,VSMC)的異常遷移是再狹窄過程中新生內膜形成和管腔阻塞的重要因素之一[1-2]。血小板源生長因子(platelet derived growth factor,PDGF)通過活化細胞內信號轉導啟動多種生物效應從而促進平滑肌細胞遷移[3]。因此抑制PDGF誘導的VSMC遷移可能對抑制再狹窄的發生發揮重要作用。芹菜素屬于類黃酮中的黃酮亞類,通常存在于水果、蔬菜和茶葉中。研究表明芹菜素具有抗炎、抗氧化和抗腫瘤特性[4-5],然而芹菜素對于VSMC活化的作用尚未完全明確。筆者在本研究探討芹菜素對PDGF-BB誘導的VSMC遷移的作用以及可能的分子機制。

1 材料與方法

1.1 材料 芹菜素(批號:10798,純度≥95%)購自Sigma公司;PDGF-BB(批號:Cyt-412)購自Prospec公司;蛋白酶抑制藥Complete(批號:04693124001),磷酸酶抑制劑PhosSTOP(批號:04906837001),購自Roche公司;DMEM/F12,胎牛血清購自Gibco公司;抗總的和磷酸化的c-Jun N末端激酶(c-Jun N-terminalkinase,JNK)抗體(批號:4668),抗甘油醛-3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH)抗體(批號:2118)購自cell signaling technology公司,抗平滑肌α-肌動蛋白(smooth muscle α-actin,SM αactin)抗體購自Abcam公司(批號:ab5694),Transwell系統購自Corning公司。

1.2 血管平滑肌細胞的培養與鑒定 采用酶消化法[6]分離血管平滑肌細胞。無菌條件下取斯潑累格·多雷(Sprague-Dawley,SD)大鼠(體質量100～150 g)胸主動脈,清除血凝塊及周圍脂肪組織,將Ⅰ型膠原酶,Ⅰ型彈性蛋白酶和大豆胰蛋白酶抑制劑配制成混合消化液,37℃預消化胸主動脈30 min,于體視顯微鏡下剝離血管外膜,將血管切成寬1 mm的血管環,再于37℃消化2 h,離心收集細胞,細胞培養于含10%胎牛血清的DMEM/F12中。待生長接近融合時傳代,血管平滑肌細胞的純度用細胞形態和VSMC SM α-actin染色鑒定。實驗使用細胞為5～12代。

1.3 細胞遷移 VSMC的異常遷移對血管新生內膜增生具有重要作用。芹菜素已被證實為有效的抑制細胞生長的物質,然而芹菜素是否對VSMC的遷移有抑制作用仍有待研究。本研究用Transwell方法評價了芹菜素對VSMC遷移的作用。參考既往文獻,選取兩個濃度的芹菜素進行研究[7]。細胞分為4組,對照組,PDGF-BB組,12.5 μmol·L-1芹菜素組,25.0 μmol·L-1芹菜素組,芹菜素組分別用不同濃度的芹菜素預處理細胞1 h后,再用PDGF趨化細胞。VSMC 25 μmol·L-1以每孔5×104個(50 μL)的密度接種于上室,貼壁30 min,將25.0 μmol·L-1芹菜素50 μL加入上室,12.5 μmol·L-1芹菜素100 μL加入下室預處理細胞1 h,隨后PDGF-BB 20 ng·mL-1加入下室作為趨化劑。細胞遷移6 h后,用棉簽拭去膜上表面未遷移的細胞,遷移到下表面的細胞用多聚甲醛固定,隨后用0.1%結晶紫/20%甲醇溶液染色并計數。遷移細胞數目定義為每高倍視野遷移細胞數量。

1.4 Western blot VSMC接種于6 cm培養皿,細胞生長至70%～80%融合后無血清饑餓24 h。12.5 μmol·L-1芹菜素預處理2 h后,予以PDGF-BB (20 ng·mL-1)刺激相應的時間。細胞用預冷的磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered solution,PBS)清洗3次,加入含有蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑的細胞裂解液裂解,14 500×g離心20 min,取上清液以BCA法測定蛋白質含量。每個樣本取蛋白提取物20 μg用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離,隨后轉印至Immobilon-FL(Millipore)膜上。含5%脫脂奶粉的洗膜緩沖液(TBST)封閉1 h,與不同的一抗4℃孵育過夜,之后與IRDye 800CW標記的二抗于室溫下孵育1 h,Odyssey Imaging System獲取熒光信號。

1.5 統計學方法 采用SPSS13.0版統計軟件進行統計學分析。數據以均數±標準差(±s)表示,均經正態性及方差齊性檢驗,多組間均數比較采用One Way ANOVA,兩組間均數比較采用LSD檢驗,P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 VSMC的鑒定 倒置顯微鏡下觀察細胞,可見單個VSMC為梭形,有多個細胞突起,細胞生長致密時排列成束,部分重疊,呈特征性的“峰”“谷”狀生長。運用免疫熒光方法對VSMC行SM α-actin染色,熒光顯微鏡下可見細胞質中與長軸平行的條絲狀綠色熒光,即為肌動蛋白,＞95%細胞染色呈陽性(圖1)。

綠色:特異性陽性染色;藍色:DAPI染色的細胞核;陽性細胞超過95%圖1 熒光顯微鏡下觀察血管平滑肌細胞SM α-actin免疫熒光染色圖(×200)Green:specific positive staining;Blue:nucleus stained by DAPI;positive cells were more than 95%Fig.1 SM α-actin staining on vascular smooth muscle cells detected by fluorescence microscopy(×200)

2.2 芹菜素對PDGF-BB誘導的VSMC遷移的影響結果顯示,與對照組比較,PDGF-BB刺激6 h顯著促進VSMC的遷移,遷移細胞數達到對照組的2.46倍,而12.5 μmol·L-1芹菜素預處理顯著抑制這一效應,遷移細胞數僅為PDGF-BB組46.5%。芹菜素的抑制作用呈現出劑量依賴的關系,25.0 μmol·L-1芹菜素即幾乎完全抑制PDGF促進VSMC的遷移(圖2)。

2.3 芹菜素抑制VSMC遷移的分子機制 由于在細胞遷移實驗中,12.5 μmol·L-1芹菜素預處理已經顯示顯著抑制VSMC遷移,因此,只選取12.5 μmol·L-1芹菜素進行分子機制的研究。PDGF-BB作用5 min后JNK即發生顯著磷酸化,而12.5 μmol·L-1芹菜素處理顯著抑制PDGF-BB對JNK的活化,PDGF-BB和芹菜素對JNK總蛋白水平均沒有影響,見圖3。

A.對照組;B.PDGF-BB組;C.12.5 μmol·L-1芹菜素組;D.25.0 μmol·L-1芹菜素組;與對照組比較,*1P＜0.05;與PDGF-BB組比較,*2P＜0.05圖2 芹菜素抑制PDGF-BB誘導的VSMC的遷移A.control group;B.PDGF-BB group;C.12.5 μmol·L-1apigenin group;D.25.0 μmol·L-1apigenin group;compared with control group,*1P＜0.05;compared with PDGF-BB group,*2P＜0.05Fig.2 Inhibition of Apigenin on migration of VSMC induced by PDGF-BB

與PDGF-BB組比較,*1P＜0.05圖3 芹菜素抑制PDGF-BB誘導的JNK磷酸化Compared with PDGF-BB group,*1P＜0.05Fig.3 Inhibition of Apigenin on JNK phosphorylation induced by PDGF-BB

3 討論

平滑肌細胞的遷移對于再狹窄的發展發揮重要作用。平滑肌細胞是新生內膜主要的細胞成分,當遷移到內膜中,平滑肌細胞異常增殖并成為細胞外基質蛋白的主要來源。因此尋找能抑制平滑肌細胞遷移的物質有助于為再狹窄的治療提供新的策略。流行病學研究發現增加攝入蔬菜和水果有助于降低腫瘤和心血管疾病引起的死亡[8]。芹菜素是廣泛存在于蔬菜和水果中的植物化合物,研究發現,芹菜素通過抗氧化作用,抑制細胞周期,促進細胞凋亡等作用機制[9-10],對多種腫瘤細胞的生長及侵襲具有顯著的抑制作用,但是芹菜素對于血管平滑肌細胞的作用目前尚未獲得一致結論[11-13]。因此本研究運用Transwell細胞遷移檢測探討芹菜素對血管平滑肌細胞遷移的作用,發現預先用芹菜素處理顯著減少PDGF-BB誘導的細胞遷移,結果提示芹菜素是VSMC遷移的抑制劑,這個結果與LAMY等[12]研究結果一致。

芹菜素抑制血管平滑肌細胞遷移的分子機制目前尚不十分清楚。既往研究證實JNK的活化在多種細胞中都與細胞遷移增強相關,因此在本研究中檢測了芹菜素對PDGF-BB誘導的JNK活化的作用。與既往研究一致,PDGF-BB誘導JNK快速的磷酸化。更重要的是,芹菜素干預導致JNK的磷酸化顯著減少,抑制血管平滑肌細胞JNK活化。ZHAN等[14]研究發現,在平滑肌細胞中轉染突變失活的JNK導致PDGF-BB誘導的VSMC遷移減少約77%。與此同時,KAVURMA等[15]也發現VSMC的遷移可以被JNK抑制劑SP600125所阻斷,這兩項研究提示了JNK活化在血管平滑肌細胞遷移中發揮了重要作用,因此芹菜素對于血管平滑肌細胞JNK活化的抑制可能是其對細胞遷移的抑制作用的機制之一。已有多項研究探討JNK參與細胞遷移調節的機制。研究顯示,粘著斑激酶可將整合素刺激信號傳導到JNK[16]。此外,細胞遷移的重要調節物Src也參與整合素到JNK的信號傳導[17]。由此可知,對于調控細胞運動的多種信號通路來說,JNK是共同的下游靶點。除了調控信號通路外,JNK還作用于細胞遷移的關鍵分子。細胞遷移需要細胞骨架重組,這個過程涉及到細胞骨架相關酪氨酸激酶的磷酸化以及粘著斑復合物的形成。paxillin是粘著斑銜接分子,研究發現,paxillin的絲氨酸178位點可以被JNK磷酸化,當這一位點發生突變而不能磷酸化時,細胞運動顯著受限,結果提示這一過程對于快速細胞遷移是必要的[18]。然而在平滑肌細胞中,芹菜素抑制JNK活化后是否影響到以上信號通路仍需進一步研究。

綜上所述,本研究證實芹菜素抑制PDGF-BB誘導的VSMC遷移,這一作用可能部分與其抑制JNK活化有關。研究提示芹菜素可能對再狹窄發生有一定的抑制作用,但這一作用仍需要通過動物實驗進一步證實。

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DOI 10.3870/yydb.2014.10.003

Effects of Apigenin on Platelet Derived Growth Factor-induced Migration of Vascular Smooth Muscle Cells

GUAN Hong-jing1,2,CUI Chang-ping1,2,HUANG Ji-you3,SHU Fen1,2
(1.Department of Cardiology,Renmin Hospital of Wuhan University,Wuhan 430060,China;2.Cardiovascular Research Institute of Wuhan University, Wuhan 430060,China;3.Medical Unit of 75240 PLA Troops,Chaozhou 521000,China)

ObjectiveTo investigate the effects of apigenin on the migration of vascular smooth muscle cells(VSMC) induced by platelet derived growth factor(PDGF)-BB and the possible molecular mechanism.MethodsVSMCs were isolated from thoracic aortas of male Sprague-Dawley rats using enzyme digestion method.Migration of VSMCs was determined by transwell assay.Western blotting was carried out to evaluate phosphorylation of c-junN-terminal kinase(JNK).ResultsTreatment with PDGF-BB(20 ng·mL-1)significantly promote VSMC migration,the number of migrated cells was 2.46 times than that of control group.However,after 12.5 μmol·L-1apigenin pretreatment,the number of migrated cells was 46.5%of the PDGF-BB group.Various dose of apigenin can significantly inhibit VSMC migration induced by PDGF-BB,12.5 μmol·L-1apigenin treatment significantly inhibited PDGF-BB phosphorylation of JNK.ConclusionApigenin can suppress the migration of VSMC induced by PDGF-BB.These beneficial effects on VSMC were at least partly mediated by the inhibition of activity of JNK.

Apigenin;Platelet derived growth factor;Vascular smooth muscle cell;Cell movement

R965

A

1004-0781(2014)10-1265-04

2013-09-17

2014-04-18

*國家自然科學基金資助項目(81070089)

關紅菁(1973-),女,遼寧新賓人,副主任醫師,博士,主要從事心臟與血管的重構研究。電話:027-88041911, E-mail:guanhj829@163.com。