人類FOXL2基因突變譜的系統(tǒng)性研究*

李艷艷畢玉張偉

人類FOXL2基因突變譜的系統(tǒng)性研究*

李艷艷①畢玉①張偉①

目的：通過對人類FOXL2基因突變譜研究，確定FOXL2基因突變分型及其與小瞼裂綜合征的相關(guān)性。方法：收集所有的突變，并對這些突變進行統(tǒng)計學處理并分類，進行蛋白表達譜分析，各功能區(qū)分析以及患者的臨床特征與突變相關(guān)性分析。結(jié)果：根據(jù)分析，將FOXL2基因突變分為10型，各分型與小瞼裂綜合征患者的臨床特征關(guān)系各不相同。單純性卵巢功能早衰患者及單純性上瞼下垂患者與FOXL2基因突變無密切相關(guān)性。結(jié)論：FOXL2的突變與BPES發(fā)病密切相關(guān)，多聚丙氨酸區(qū)域的喪失與Ⅰ型BPES密切相關(guān)。FOXL2的突變與單純性POF及上瞼下垂的發(fā)病關(guān)系并不密切。

小瞼裂綜合征； FOXL2； 卵巢功能早衰； 突變

FOXL2基因是一個2.7 kb的單外顯子基因，編碼376個氨基酸，預(yù)期的蛋白質(zhì)屬于翼狀螺旋/叉頭型轉(zhuǎn)錄因子調(diào)節(jié)家族，包含一個特有的101個氨基酸的forkhead DNA結(jié)構(gòu)域和一個與此分離但功能尚未闡明的多聚丙氨酸肽段。小瞼裂綜合征（BPES）是表現(xiàn)為瞼裂狹小、上瞼下垂和倒轉(zhuǎn)型內(nèi)眥贅皮等一系列癥狀的常染色體顯性遺傳病。臨床上分為兩型：Ⅰ型：女性患者不育，原發(fā)閉經(jīng)或提前絕經(jīng)、小子宮和卵巢功能早衰；Ⅱ型：男女患者均可生育。目前研究證實FOXL2基因與BPES的發(fā)病密切相關(guān)，是首選致病基因。

1 材料與方法

1.1 材料 參考The human FOXL2 mutation database （http：//medgen.ugent.be/foxl2/）[1]，搜集所有報道過的突變，共發(fā)現(xiàn)有144個變異位點，其中包括15個單核苷酸多態(tài)位點。對這些突變進行統(tǒng)計學處理并分類，同時進行蛋白表達譜分析，各功能區(qū)分析，以及患者的臨床特征與突變相關(guān)性分析。

1.2 突變位點的研究方法 （1）直接測序；（2）多重性連接依賴的探針擴增法；（3）微衛(wèi)星位點分析和單核苷酸多態(tài)性分析；（4）熒光原位雜交技術(shù)分析。

1.3 前期實驗結(jié)果的分析 筆者對一期收集到的29 例BPES患者血樣進行FOXL2基因突變研究，并將前期實驗中所得的突變結(jié)果進行分析歸類[2-3]。

2 結(jié)果

2.1 FOXL2的功能區(qū) FOXL2的功能區(qū)包括forkhead DNA結(jié)合域（第52～152殘基區(qū)域）、功能尚未闡明的多聚丙氨酸肽段（221～234位氨基酸殘基區(qū)）以及轉(zhuǎn)錄激活區(qū)（第280～320殘基區(qū)域），見圖1。

圖1 FOXL2的結(jié)構(gòu)示意圖

2.2 分類結(jié)果 突變譜共分10型，具體分型如下：A：蛋白截短，無forkhead DNA結(jié)合域及其后的所有氨基酸；B：蛋白截短，包含部分forkhead DNA結(jié)合域；C：蛋白截短，包含完整forkhead DNA結(jié)合域，無多聚丙氨酸肽段及轉(zhuǎn)錄激活區(qū)；D：蛋白截短，包含完整forkhead DNA結(jié)合域和完整的多聚丙氨酸肽段，無轉(zhuǎn)錄激活區(qū)；E：轉(zhuǎn)錄激活區(qū)域突變，蛋白截短或延長，包含完整forkhead DNA結(jié)合域和完整的多聚丙氨酸肽段；F：轉(zhuǎn)錄激活區(qū)后的突變，蛋白截短或延長，包含完整forkhead DNA結(jié)合域、多聚丙氨酸肽段及轉(zhuǎn)錄激活區(qū)；G：多聚丙氨酸肽段框架內(nèi)移碼突變，蛋白延長或截短；H：只有錯義突變，單個堿基的替換或顛換；I：包括微缺失及FOXL2基因與其他基因的染色體重排；J：其他突變，包括5′-UTR和3′-UTR區(qū)域變異。

2.3 患者的臨床特征與突變相關(guān)性分析結(jié)果 所有發(fā)現(xiàn)突變的患者均為典型的BPES，兩型BPES存在著基因型和表現(xiàn)型的相互關(guān)聯(lián)。同一個突變可導(dǎo)致明顯的家系內(nèi)和家系間的表型多樣性，即表現(xiàn)型和基因型的多樣性。

A組突變由于forkhead區(qū)域的破壞致DNA結(jié)合能力的下降，從而導(dǎo)致FOXL2的單型缺陷；由于缺乏相關(guān)的信息，對B組不能作出相關(guān)性判斷；C組，蛋白截短，無多聚丙氨酸肽段及多聚脯氨酸肽段，發(fā)生POF幾率非常高，多為BPESⅠ型；D組，具有完整的forkhead和聚丙氨酸區(qū)域，蛋白截短，家系內(nèi)存在表現(xiàn)型的多樣性；E組，具有完整的forkhead和聚丙氨酸區(qū)域，移碼突變導(dǎo)致蛋白延長，導(dǎo)致Ⅰ型和Ⅱ型BPES；F組的基因型與表現(xiàn)型亦不能作出相關(guān)性判斷；G組的多聚丙氨酸肽段突變框架移碼突變，導(dǎo)致聚丙氨酸擴增，發(fā)生在Ⅱ型BPES家系和類型不明確的家系中。多聚丙氨酸肽段延長，導(dǎo)致聚丙氨酸擴增，多發(fā)生在Ⅱ型BPES家系；H組錯義突變，由于病例數(shù)量少及缺乏相關(guān)的信息，不能作出判斷；I組發(fā)生在散發(fā)的患者和家族性BPES，多伴發(fā)智力低下；J組未引起任何蛋白變異，由于病例數(shù)量少及缺乏相關(guān)的信息，不能作出相關(guān)性判斷。

單純的卵巢功能早衰（POF）患者中發(fā)現(xiàn)的FOXL2的變異均為單核苷酸多態(tài)性（SNP），筆者對30例單純性上瞼下垂患者的FOXL2基因進行突變分析時未發(fā)現(xiàn)此基因的突變。

2.4 前期實驗中的突變的分析及歸類 筆者對一期收集到的29例BPES患者及100例眼瞼發(fā)育正常的人的血樣提取FOXL2基因進行突變研究，發(fā)現(xiàn)的3個突變位點分別為892C＞T、951～953delC及901～930dup30。

892C＞T為無義突變，蛋白截短，包含完整forkhead DNA結(jié)合域，但無多聚丙氨酸肽段及多聚脯氨酸肽段，屬于C組；951～953delC為缺失突變后引起移碼突變，蛋白截短，包含完整forkhead DNA結(jié)合域和多聚丙氨酸肽段，無多聚脯氨酸肽段，屬于D組；901～930dup30為重復(fù)突變，多聚丙氨酸肽段框架內(nèi)移位突變，蛋白延長，屬于G組。

另外，據(jù)報道的中國人BPES患者中FOXL2基因的突變共有24種，除去筆者報道的3種[2-3]，其余21種分組情況如下：475dupC屬于B組；704delG及804dupC屬于D組；1091 delC屬于E組；1041～1042 insC屬 于 F組；909～938 dup30及 933～965dup33屬于G組；H組突變比較多，分別為425 T＞C；773C＞G；655C＞T；370 A＞G；340A＞G；384G＞A；241T＞C；650C＞G；50C→TA及2293-2294insT屬于J組；其中672～701dup30；663～692dup30以及858～874dup17不屬于以上突變分型的任何分組，提示在這些突變區(qū)域可能存在其他功能部位[4-13]。

3 討論

轉(zhuǎn)錄因子的轉(zhuǎn)錄激活區(qū)分為3類：酸性激活區(qū)、谷氨酰胺富含區(qū)和脯氨酸富含區(qū)。國內(nèi)外學者對FOXL2功能區(qū)的研究只提出其forkhead DNA結(jié)合區(qū)和一個與此分離的多聚丙氨酸區(qū)域，并未提及轉(zhuǎn)錄激活區(qū)。通過對FOXL2功能域的分析，未發(fā)現(xiàn)明顯的酸性區(qū)及谷氨酰胺富含區(qū)，只有一個脯氨酸富含區(qū)，即280～320區(qū)域，此區(qū)內(nèi)脯氨酸含量高達45%，因此，筆者認為此區(qū)為FOXL2的轉(zhuǎn)錄激活區(qū)。另外，突變譜的結(jié)果亦顯示此區(qū)域為突變高發(fā)區(qū)，認為是由于轉(zhuǎn)錄激活區(qū)的突變使轉(zhuǎn)錄因子失去轉(zhuǎn)錄功能而導(dǎo)致其作用蛋白的功能異常，從而導(dǎo)致疾病的發(fā)生。

突變類型的分組與De Baere等[14]的分組略有不同，筆者主要是根據(jù)FOXL2功能區(qū)進行突變類型的分組，如此可以更好的了解FOXL2突變與功能的關(guān)系，從而為明確FOXL2的確切致病機理提供依據(jù)。De Baere等[14]在對多例BPES家系研究后提出由同一個突變可導(dǎo)致明顯的家系內(nèi)和家系間的表型多樣性，即表現(xiàn)型和基因型的多樣性，筆者認為主要是由于基因背景不同和基因的相互作用造成的。

FOXL2控制瞼裂發(fā)育的目標基因尚不清楚。據(jù)推測，F(xiàn)OXL2很可能是控制某些基因，如TGF-α、EGFr、Inhbb、控制睜眼及瞼裂的基因位點，而這些基因與其他與眼前節(jié)發(fā)育有關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子共同影響瞼裂的發(fā)育，如Pax6、Bmp4、Bmp7等[15-16]。另外，有研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)OXL2的一個同源基因FOXO對某些調(diào)節(jié)細胞周期的抗凋亡或促凋亡基因有調(diào)節(jié)作用。FOXL2可能參與了對胚胎早期眼瞼及眼周肌肉發(fā)育過程中某些調(diào)節(jié)細胞周期的抗凋亡或促凋亡基因的調(diào)節(jié)，其具體的作用機制，還有待于進一步地研究證實。

綜上所述，F(xiàn)OXL2的突變與BPES發(fā)病密切相關(guān)，任何區(qū)域的突變都可以導(dǎo)致其功能異常，從而導(dǎo)致BPES。多聚丙氨酸區(qū)域的喪失與Ⅰ型BPES密切相關(guān)。FOXL2的突變與單純性POF及上瞼下垂的發(fā)病關(guān)系并不密切。

[1] Beysen D，Vandesompele J，Messiaen L，et al.The human FOXL2 mutation database[J].Hum Mutat，2004，24（11）：189-193.

[2] Tang S，Wang X，Lin L，et al.Mutation analysis of the FOXL2 gene in Chinese patients with blepharophimosis-ptosis-epicanthus inversus syndrome[J].Mutagenesis，2006，21（1）：35-39.

[3] Li W X，Wang X K，Sun Y，et al.A novel mutation in the FOXL2 gene in a Chinese family with blepharophimosis， ptosis， and epicanthus inversus syndrome[J].Chinese Journal of Medical Genetics，2005，22（4）：372-375.

[4] Jiang H，Huang X，Su Z，et al.Genetic analysis of the forkhead transcriptional factor 2 gene in three Chinese families with blepharophimosis syndrome[J].Mol Vis，2013，19（2）：418-423.

[5] Ye J，Shi X，He J J，et al.Mutation analysis of FOXL2 gene in Chinese patients with blepharophimosis-ptosis-epicanthus inversus syndrome[J].Chinese Journal of Ophthalmology，2011，47（11）：1007-1011.

[6] Hu S，Guo J，Wang B，et al.Genetic analysis of the FOXL2 gene using quantitative real-time PCR in Chinese patients with blepharophimosis-ptosis-epicanthus inversus syndrome[J].Mol Vis，2011，17（5）：436-442.

[7] Zhou Z M，Liang D S，Quan Y，et al.Deletion and mutation analysis to FOXL2 in blepharophimosis-ptosis-epicanthus inversus syndrome[J].Chinese Journal of Ophthalmology，2010，46（6）：532-536.

[8] Lin W D，Chou I C，Lee N C，et al.FOXL2 mutations in Taiwanese patients with blepharophimosis， ptosis， epicanthus inversus syndrome[J].Clin Chem Lab Med，2010，48（4）：485-488.

[9] Wang J，Liu J，Zhang Q.FOXL2 mutations in Chinese patients with blepharophimosis-ptosis-epicanthus inversus syndrome[J].Mol Vis，2007，13（8）：108-113.

[10] Qi Y H，Li Y，Lin H，et al.Mutation analysis of FOXL2 inChinese patients with blepharophimosis-ptosis-epicanthus inversus syndrome[J].Chinese Journal of Ophthalmology，2006，42（5）：409-414.

[11] FOXL2 mutations and genomic rearrangements in BPES[J].Human Mutation，2009，30（2）：158-169.

[12] Qian X，Shu A，Qin W，et al.A novel insertion mutation in the FOXL2 gene is detected in a big Chinese family with blepharophimosis-ptosis-epicanthus inversus[J].Mutat Res，2004，554（1）：19-22.

[13] Qi Y H，Li Y，Lin H，et al.Mutation analysis of FOXL2 in Chinese patients with blepharophimosis-ptosis-epicanthus inversus syndrome[J].Chinese Journal of Ophthalmology，2006，42（5）：409-414.

[14] De Baere E，Beysen D，Oley C，et al.FOXL2 and BPES： mutational hotspots， phenotypic variability， and revision of the genotypephenotype correlation[J].Nat Genet，2003，72（2）：159-166.

[15] Praphanphoj V，Goodman B K，Thomas G H，et al.Molecular cytogenetic evaluation in a patient with a translocation （3；21）associated with blepharophimosis， ptosis， epicanthus inversus syndrome （BPES）[J].Genomics，2000，65（5）：67-69.

[16] Schmidt D，Ovitt C E，Anlag K，et al.The murine winged-helix transcription factor Foxl2 is required for granulosa cell differentiation and ovary maintenance[J].Development，2004，131（25）：933-942.

Systemic Study of FOXL2 Mutations in Human

LI Yan-yan，BI Yu，ZHANG Wei.//Medical Innovation of China，2014，11（24）：021-024

Objective：To classify all mutations in the FOXL2， and get the relationship between FOXL2 mutations and BPES.Method：All mutations of FOXL2 which had been reported in families with BPES， were collected and classified， the predicted protein， the domain structure and the relationship with BPES were analyzed.Result：All the FOXL2 mutations could be subdivided into 10 classes. Different mutational classifications had different relationships between FOXL2 mutations and BPES. The FOXL2 had little correlativity with premature ovarian failure and congenital ptosis patients.Conclusion：The mutations of FOXL2 have nearly correlativity with BPES. Mutations which results in truncated protein without poly Ala tract always lead to type I BPES. The FOXL2 has little correlativity with premature ovarian failure and congenital ptosis patients.

Blepharophimosis-ptosis-epicanthus inversus syndrome； FOXL2； Premature ovarian failure；Mutation

10.3969/j.issn.1674-4985.2014.24.007

2014-06-12） （本文編輯：蔡元元）

國家自然科學基金資助項目（81301647）；山東省自然科學基金資助項目（ZR2013HQ025）；山東省醫(yī)藥衛(wèi)生科技發(fā)展計劃資助項目（2011QW032）

①濰坊醫(yī)學院 山東 濰坊 261041

張偉

First-author’s address：Weifang Medical University，Weifang 261041，China