人類FOXL2基因突變譜的系統性研究

李艷艷　畢玉　張偉

【摘要】 目的：通過對人類FOXL2基因突變譜研究，確定FOXL2基因突變分型及其與小瞼裂綜合征的相關性。方法：收集所有的突變，并對這些突變進行統計學處理并分類，進行蛋白表達譜分析，各功能區分析以及患者的臨床特征與突變相關性分析。結果：根據分析，將FOXL2基因突變分為10型，各分型與小瞼裂綜合征患者的臨床特征關系各不相同。單純性卵巢功能早衰患者及單純性上瞼下垂患者與FOXL2基因突變無密切相關性。結論：FOXL2的突變與BPES發病密切相關，多聚丙氨酸區域的喪失與Ⅰ型BPES密切相關。FOXL2的突變與單純性POF及上瞼下垂的發病關系并不密切。

【關鍵詞】 小瞼裂綜合征； FOXL2； 卵巢功能早衰； 突變

FOXL2基因是一個2.7 kb的單外顯子基因，編碼376個氨基酸，預期的蛋白質屬于翼狀螺旋/叉頭型轉錄因子調節家族，包含一個特有的101個氨基酸的forkhead DNA結構域和一個與此分離但功能尚未闡明的多聚丙氨酸肽段。小瞼裂綜合征（BPES）是表現為瞼裂狹小、上瞼下垂和倒轉型內眥贅皮等一系列癥狀的常染色體顯性遺傳病。臨床上分為兩型：Ⅰ型：女性患者不育，原發閉經或提前絕經、小子宮和卵巢功能早衰；Ⅱ型：男女患者均可生育。目前研究證實FOXL2基因與BPES的發病密切相關，是首選致病基因。

1 材料與方法

1.1 材料 參考The human FOXL2 mutation database（http：//medgen.ugent.be/foxl2/）[1]，搜集所有報道過的突變，共發現有144個變異位點，其中包括15個單核苷酸多態位點。對這些突變進行統計學處理并分類，同時進行蛋白表達譜分析，各功能區分析，以及患者的臨床特征與突變相關性分析。

1.2 突變位點的研究方法 （1）直接測序；（2）多重性連接依賴的探針擴增法；（3）微衛星位點分析和單核苷酸多態性分析；（4）熒光原位雜交技術分析。

1.3 前期實驗結果的分析 筆者對一期收集到的29例BPES患者血樣進行FOXL2基因突變研究，并將前期實驗中所得的突變結果進行分析歸類[2-3]。

2 結果

2.1 FOXL2的功能區 FOXL2的功能區包括forkhead DNA結合域（第52～152殘基區域）、功能尚未闡明的多聚丙氨酸肽段（221～234位氨基酸殘基區）以及轉錄激活區（第280～320殘基區域）。

2.2 分類結果 突變譜共分10型，具體分型如下：A：蛋白截短，無forkhead DNA結合域及其后的所有氨基酸；B：蛋白截短，包含部分forkhead DNA結合域；C：蛋白截短，包含完整forkhead DNA結合域，無多聚丙氨酸肽段及轉錄激活區；D：蛋白截短，包含完整forkhead DNA結合域和完整的多聚丙氨酸肽段，無轉錄激活區；E：轉錄激活區域突變，蛋白截短或延長，包含完整forkhead DNA結合域和完整的多聚丙氨酸肽段；F：轉錄激活區后的突變，蛋白截短或延長，包含完整forkhead DNA結合域、多聚丙氨酸肽段及轉錄激活區；G：多聚丙氨酸肽段框架內移碼突變，蛋白延長或截短；H：只有錯義突變，單個堿基的替換或顛換；I：包括微缺失及FOXL2基因與其他基因的染色體重排；J：其他突變，包括5′-UTR和3′-UTR區域變異。

2.3 患者的臨床特征與突變相關性分析結果 所有發現突變的患者均為典型的BPES，兩型BPES存在著基因型和表現型的相互關聯。同一個突變可導致明顯的家系內和家系間的表型多樣性，即表現型和基因型的多樣性。

A組突變由于forkhead區域的破壞致DNA結合能力的下降，從而導致FOXL2的單型缺陷；由于缺乏相關的信息，對B組不能作出相關性判斷；C組，蛋白截短，無多聚丙氨酸肽段及多聚脯氨酸肽段，發生POF幾率非常高，多為BPESⅠ型；D組，具有完整的forkhead和聚丙氨酸區域，蛋白截短，家系內存在表現型的多樣性；E組，具有完整的forkhead和聚丙氨酸區域，移碼突變導致蛋白延長，導致Ⅰ型和Ⅱ型BPES；F組的基因型與表現型亦不能作出相關性判斷；G組的多聚丙氨酸肽段突變框架移碼突變，導致聚丙氨酸擴增，發生在Ⅱ型BPES家系和類型不明確的家系中。多聚丙氨酸肽段延長，導致聚丙氨酸擴增，多發生在Ⅱ型BPES家系；H組錯義突變，由于病例數量少及缺乏相關的信息，不能作出判斷；I組發生在散發的患者和家族性BPES，多伴發智力低下；J組未引起任何蛋白變異，由于病例數量少及缺乏相關的信息，不能作出相關性判斷。

單純的卵巢功能早衰（POF）患者中發現的FOXL2的變異均為單核苷酸多態性（SNP），筆者對30例單純性上瞼下垂患者的FOXL2基因進行突變分析時未發現此基因的突變。

2.4 前期實驗中的突變的分析及歸類 筆者對一期收集到的29例BPES患者及100例眼瞼發育正常的人的血樣提取FOXL2基因進行突變研究，發現的3個突變位點分別為892C>T、951～953delC及901～930dup30。

892C>T為無義突變，蛋白截短，包含完整forkhead DNA結合域，但無多聚丙氨酸肽段及多聚脯氨酸肽段，屬于C組；951～953delC為缺失突變后引起移碼突變，蛋白截短，包含完整forkhead DNA結合域和多聚丙氨酸肽段，無多聚脯氨酸肽段，屬于D組；901～930dup30為重復突變，多聚丙氨酸肽段框架內移位突變，蛋白延長，屬于G組。

另外，據報道的中國人BPES患者中FOXL2基因的突變共有24種，除去筆者報道的3種[2-3]，其余21種分組情況如下：475dupC屬于B組；704delG及804dupC屬于D組；1091 delC屬于E組；1041～1042 insC屬于F組；909～938 dup30及933～965dup33屬于G組；H組突變比較多，分別為425 T>C；773C>G；655C>T；370 A>G；340A>G；384G>A；241T>C；650C>G；50C→TA及2293-2294insT屬于J組；其中672～701dup30；663～692dup30以及858～874dup17不屬于以上突變分型的任何分組，提示在這些突變區域可能存在其他功能部位[4-13]。endprint

3 討論

轉錄因子的轉錄激活區分為3類：酸性激活區、谷氨酰胺富含區和脯氨酸富含區。國內外學者對FOXL2功能區的研究只提出其forkhead DNA結合區和一個與此分離的多聚丙氨酸區域，并未提及轉錄激活區。通過對FOXL2功能域的分析，未發現明顯的酸性區及谷氨酰胺富含區，只有一個脯氨酸富含區，即280～320區域，此區內脯氨酸含量高達45%，因此，筆者認為此區為FOXL2的轉錄激活區。另外，突變譜的結果亦顯示此區域為突變高發區，認為是由于轉錄激活區的突變使轉錄因子失去轉錄功能而導致其作用蛋白的功能異常，從而導致疾病的發生。

突變類型的分組與De Baere等[14]的分組略有不同，筆者主要是根據FOXL2功能區進行突變類型的分組，如此可以更好的了解FOXL2突變與功能的關系，從而為明確FOXL2的確切致病機理提供依據。De Baere等[14]在對多例BPES家系研究后提出由同一個突變可導致明顯的家系內和家系間的表型多樣性，即表現型和基因型的多樣性，筆者認為主要是由于基因背景不同和基因的相互作用造成的。

FOXL2控制瞼裂發育的目標基因尚不清楚。據推測，FOXL2很可能是控制某些基因，如TGF-α、EGFr、Inhbb、控制睜眼及瞼裂的基因位點，而這些基因與其他與眼前節發育有關的轉錄因子共同影響瞼裂的發育，如Pax6、Bmp4、Bmp7等[15-16]。另外，有研究發現，FOXL2的一個同源基因FOXO對某些調節細胞周期的抗凋亡或促凋亡基因有調節作用。FOXL2可能參與了對胚胎早期眼瞼及眼周肌肉發育過程中某些調節細胞周期的抗凋亡或促凋亡基因的調節，其具體的作用機制，還有待于進一步地研究證實。

綜上所述，FOXL2的突變與BPES發病密切相關，任何區域的突變都可以導致其功能異常，從而導致BPES。多聚丙氨酸區域的喪失與Ⅰ型BPES密切相關。FOXL2的突變與單純性POF及上瞼下垂的發病關系并不密切。

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（收稿日期：2014-06-12） （本文編輯：蔡元元）endprint

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