紅景天冠心方對大鼠心肌缺血損傷保護作用的實驗研究

朱鴻哲

（1.哈爾濱體育學院，黑龍江哈爾濱150008；2.黑龍江中醫藥大學，黑龍江哈爾濱150040）

紅景天冠心方對大鼠心肌缺血損傷保護作用的實驗研究

朱鴻哲1，2

（1.哈爾濱體育學院，黑龍江哈爾濱150008；2.黑龍江中醫藥大學，黑龍江哈爾濱150040）

目的本實驗觀察紅景天冠心方對實驗性心肌缺血大鼠的保護作用，并對其機理進行初步的探討。方法采用異丙腎上腺素誘導模型，觀察紅景天冠心方對大鼠心肌缺血發生率、形態學變化的影響，同時測定大鼠心肌組織中MDA、SOD含量并用Western blotting法檢測凋亡相關蛋白p53的表達。結果紅景天冠心方可以降低異丙腎上腺素誘導模型動物心肌缺血的發生率，改善病理形態學變化，同時增加實驗性心肌缺血大鼠心肌中SOD的含量，降低MDA含量，抑制p53蛋白的表達。結論紅景天冠心方對實驗性心肌缺血大鼠具有保護作用，其機理可能與清除自由基、抗氧化的同時抑制心肌細胞凋亡相關。

紅景天冠心方；心肌缺血；自由基；細胞凋亡

紅景天冠心方是以紅景天為君藥，配以三七、柴胡和太子參等多味藥物組成，具有益氣活血、行氣止痛之功效，臨床主要用于心腦血管疾病的治療，本文重點探討其在對抗心肌缺血方面的藥理作用并初步探討其作用機理，為其臨床應用提供理論及實驗依據。

1 材料

1.1 實驗動物 健康Wistar大鼠100只，雌雄各半，體重200～220 g，由吉林大學白求恩醫學院動物實驗中心提供，生產許可證號SCXK（吉）2008－0005。

1.2 實驗藥品 紅景天冠心方：自制。氯化鈉注射液：哈爾濱三聯藥業有限公司，批號：121108A2；鹽酸異丙腎上腺素：上海禾豐制藥有限公司，批號：110401；地奧心血康膠囊：成都地奧制藥有限公司，批號：1108090；β－action（sc－47778），p53（sc－1311），HRP兔抗羊二抗均購自Sigma公司。

2 實驗方法

2.1 紅景天冠心方對實驗性大鼠心肌缺血發生率的影響 將每只大鼠在分組前做心電圖檢查，棄去其中心律失常、ST段改變、T波異常的大鼠，將心電圖檢查合格的50只Wistar大鼠隨分成5組，每組10只動物，分別為紅景天冠心方高劑量組、紅景天冠心方低劑量組、陽性對照組、模型對照組及空白對照組。其中紅景天冠心方高劑量組給予100 mg·kg－1，紅景天冠心方低劑量組給予50 mg·kg－1，陽性對照組給予地奧心血康膠囊120 mg·kg－1，空白對照組、模型對照組給予等體積氯化鈉注射液，各組均灌胃給藥，每日1次，連續15 d。除空白對照組外，各組動物第13、14天連續腹腔注射鹽酸異丙腎上腺素5 mg·kg－1，空白組給予等體積氯化鈉注射液。于末次給藥后30 min，各組大鼠分別以3.5%戊巴比妥鈉（35 mg·kg－1）麻醉，仰位固定，連接心電圖機，進行心電圖檢查。走紙速度100 mm·s－1，標準電壓10 mm·mV－1。此時腹腔注射鹽酸異丙腎上腺素（5mg·kg－1），空白組給予等容量的生理鹽水，記錄腹腔注射鹽酸腎上腺素注射液前及記錄成模后即刻、5、10、20、30 min標準肢體Ⅱ導聯心電圖變化，觀察各組大鼠心肌缺血的發生率。造模成功的標志為模型對照組動物心電圖中S－T段抬高≥0.1 mV。陰性判斷標準：①T波低平或雙向倒置；②ST段斜形偏移，或水平偏移＜0.1 mV。試驗動物心電圖改變具備以下條件之一者即可判斷為心肌缺血陽性：①心動過速、期前收縮或其他心律失常；②出現異常Q波；③ST段水平向下或向上偏移≥0.1 mV；④T波高聳超過同導聯R波的1／2；⑤T波高聳伴ST段移位。

2.2 紅景天冠心方對實驗性心肌缺血大鼠病理學變化的影響 造模、分組、給藥及操作過程同“2.1”項下。在造模成功1 h后及頸總動脈取血后，處死大鼠，取心臟，用生理鹽水沖洗除去血污，剔除脂肪組織等非心肌組織，順房室溝從心尖到心基底部平行將心室切開，取心室肌組織修成大約lmm3的小塊，置4%甲醛溶液中固定24 h。HE染色后，于光學顯微鏡下觀察心肌組織的損傷程度。

2.3 紅景天冠心方對實驗性心肌缺血大鼠心肌組織自由基的影響 造模、分組、給藥及操作過程同“2.1”項下。造模成功后1 h后及頸總動脈取血后，處死大鼠，取心臟，用生理鹽水沖洗除去血污，剔除脂肪組織等非心肌組織，順房室溝從心尖到心基底部平行將心室切開，取心室肌組織，于電子天平稱重，標記好放入事先準備好的凍存管內，置于液氮中保存備用。檢測時樣本解凍，樣本及試劑需平衡至室溫后，按試劑盒說明書操作，用722分光光度計檢測實驗性心肌缺血大鼠心肌勻漿中MDA、SOD數據并統計。

2.4 Western blotting法檢測紅景天冠心方對實驗性心肌缺血大鼠心肌組織凋亡相關蛋白p53表達的影響 造模、分組、給藥及操作過程同“2.1”項下。造模成功后1 h后及頸總動脈取血后，處死大鼠，取心臟，用生理鹽水沖洗除去血污，剔除脂肪組織等非心肌組織，順房室溝從心尖到心基底部平行將心室切開，取心室肌組織，于電子天平稱重，取約0.1 g，標記好放入事先準備好的凍存管內，置于液氮中保存備用。經SDS－PAGE電泳檢測心肌組織凋亡相關蛋白p53的表達，膠片采用Alpha image 2000凝膠成像系統掃描，所得圖形使用Image－proplus進行定性分析。

3 統計學處理

結果采用Spss 11.5 for Windows統計軟件分析處理，組間比較采用t檢驗，以P＜0.05或P＜0.01作為顯著性差異。所得數據以均數±標準差表示。

4 結果

4.1 紅景天冠心方對實驗性大鼠心肌缺血發生率的影響 紅景天冠心方對實驗性大鼠心肌缺血發生率的影響，結果見表1。

表1 紅景天冠心方對實驗性大鼠心肌缺血發生率的影響

表1結果表明，模型對照組大鼠心肌缺血發生率100%，說明造模成功，其余各組與模型對照組比較心肌缺血發生率降低，紅景天冠心方給藥組及陽性對照組比較未見差異，表明一定劑量的紅景天冠心方可以降低異丙腎上腺素誘導模型動物心肌缺血的發生率。

4.2 紅景天冠心方對實驗性心肌缺血大鼠病理學變化的影響 結果見圖1。

圖1 紅景天冠心方對實驗性心肌缺血大鼠病理學變化的影響

光學顯微鏡下觀察心肌組織的損傷程度，結果顯示空白對照組（圖1 A）：肌束排列整齊，輕度肌纖維斷裂，輕度炎性細胞浸潤，輕度血管擴張，輕度心肌纖維化。模型對照組（圖1 B）：肌束排列不整齊，重度肌纖維斷裂，重度炎性細胞浸潤，重度血管擴張，重度心肌纖維化及間質水腫。紅景天冠心方高劑量組（圖1 C）：肌束排列整齊，中度炎性細胞浸潤，輕度血管擴張，輕度心肌纖維化。紅景天冠心方低劑量組（圖1 D）：肌束排列不整齊，重度肌纖維斷裂，重度炎性細胞浸潤，中度血管擴張，重度心肌纖維化及間質水腫。陽性對照組（圖1 E）：輕度肌纖維斷裂，輕度炎癥，輕度血管擴張，輕度心肌纖維化及間質水腫。

4.3 紅景天冠心方對實驗性心肌缺血大鼠心肌組織自由基的影響 結果見表2。

表2 紅景天冠心方對實驗性心肌缺血大鼠心肌組織自由基的影響（±s）

表2 紅景天冠心方對實驗性心肌缺血大鼠心肌組織自由基的影響（±s）

注：與模型對照組比較，★P＜0.05，★★P＜0.01；與空白對照組比較，▲P＜0.05，▲▲P＜0.01

組別 例數（只）劑量（mg·kg－1）SOD含量（U·mL－1）MDA含量（nmol·mg－1）模型對照組 10 等體積 8.22±0.85▲▲ 13.62±1.11▲▲12.21±0.74 6.38±0.91高劑量組 10 100 9.68±1.27★★ 11.20±1.41★★低劑量組 10 50 9.06±0.66★ 11.76±1.83★陽性對照組 10 120 9.81±1.11★★ 11.17±2.53★空白對照組 10 等體積

表2結果可知，模型對照組與空白對照組比較，心肌組織中SOD含量下降，差異具有統計學意義（P＜0.01），而各給藥組分別與模型對照組比較均能不同程度的增加心肌組織中SOD含量，差異具有統計學意義（P＜0.01或P＜0.05）。模型對照組與空白對照組比較，心肌組織中MDA含量增加，差異具有統計學意義（P＜0.01），而各給藥組分別與模型對照組比較均能不同程度的降低心肌組織中MDA含量，差異具有統計學意義（P＜0.01或P＜0.05）。

4.4 Western blotting法檢測紅景天冠心方對實驗性心肌缺血大鼠心肌組織凋亡相關蛋白p53表達的影響 結果見圖2。

圖2 紅景天冠心方對實驗性心肌缺血大鼠心肌組織凋亡p53表達的影響

圖2定性分析結果顯示，空白對照組p53表達降低，模型對照組p53蛋白表達升高，紅景天冠心方高、低及陽性對照組p53蛋白的表達較模型對照組降低。

5 討論

心肌缺血損傷是一種多因素參與的復雜病理過程，涉及多個環節。心肌缺血伴有大量自由基生成導致心肌細胞膜中不飽和脂肪酸發生脂質過氧化反應而加重心肌缺血［1］。氧化應激是指過量的活性氧與內源性清除活性氧的抗氧化系統間失去平衡［2］。活性氧對于血管細胞主要參與血管壁損傷，特別是斑塊的形成、破裂與血栓形成，引起血管性病變。因此，丙二醛（MDA）是評價心肌缺血指標之一。超氧化物歧化酶（SOD）具有清除氧自由基作用，所以SOD活性亦可作為評價心肌缺血的間接指標。同時，在心肌缺血損傷中有大量的心肌細胞經歷了凋亡過程［3］。細胞凋亡是細胞在正常生理或病理狀態下發生的一種自發的、程序化的死亡過程。心肌缺血可引起缺血區及缺血邊緣區心肌細胞死亡，隨后可發展為心肌梗死［4］。

紅景天冠心方可以降低異丙腎上腺素誘導模型動物心肌缺血的發生率，改善病理形態學變化，同時增加實驗性心肌缺血大鼠心肌中SOD的含量，降低MDA含量，抑制p53蛋白的表達，推測其對實驗性心肌缺血保護作用的機理與清除自由基、抗氧化的同時抑制心肌細胞凋亡相關。

［1］Murphy E，Steenbergen C.Mechanism underlying acuteprotection from cardiac ischemia－reperfusion injury［J］.Physiol Rev，2008，88（2）：581－609.

［2］陳瑗，周玫.氧化應激－炎癥在動脈粥樣硬化發生發展中作用研究的新進展［J］.中國動脈硬化雜志，2008，16（10）：757－762.

［3］羅海潘，官全生，丘睿業.大鼠急性心肌缺血后心肌細胞凋亡的研究［J］.臨床和實驗醫學雜志，2010，9（18）：1361－1363.

［4］郝言杰，王元書，解硯英，等.心肌細胞凋亡與梗死的研究進展［J］.食品與藥品，2009，11（1）：58－61.

Study on protective effects of Hongjingtian Guanxinfang on myocardial ischem ia in rats

ZHU Hong-zhe1，2
（1.Harbin Institute of Physical Education，Harbin 150008，China；2.Heilongjiang University of Chinese Medicine，Harbin 150040，China）

ObjectiveTo discuss the protective effect of Hongjingtian Guanxinfang on myocardial ischemia in rats.M ethodsThemyocardial ischemia ratsmodelweremade by intraperitoneal injection of hydrochloric acid isoproterenol，to observe the effect of Hongjingtian Guanxinfang on themorphological changes ofmyocardial ischemia of rats，the expression of simultaneous determination of MDA，SOD in myocardial tissue in rats and the expression of p53 protein with Western blotting.ResultsHongjingtian Guanxinfang can reduce the incidence ofmyocardial ischemia induced with isoproterenol，improve the pathological changes，increase the contentof SOD，decrease the contentofMDA of experimentalmyocardial ischemia in rats and inhibit the expression of p53 protein.ConclusionHongjingtian Guanxinfang had the protective effect on experimentalmyocardial ischemia in rats，and itsmechanism may be related to scavenging free radical，antioxidant and inhibitingmyocardial apoptosis.

Hongjingtian Guanxinfang；Myocardial ischemia；Free radical；Apoptosis

R285

A

2095－5375（2014）02－0068－004

朱鴻哲，男，研究方向：運動醫學與藥理學，E－mail：zhu.hongzhe＠aliyun.com