基因多態性與抗血小板藥物個體化治療研究

邵淵，丁紅，徐運

1 引言

腦血管疾病為常見病，它與心臟病、惡性腫瘤構成了當前全球的三大致死疾病。其致殘率居全球第一。我國衛生部2008年4月公布的第三次死因調查結果[1]顯示，全國每年新發腦血管病患者約200萬人，其中2/3致死或致殘。我國內地每年因腦血管病的總支出近500億元，卒中已成為國內第一位的死因[2]。其中腦梗死（cerebral infarction，CI）又稱缺血性卒中，占卒中的80%左右，其高發病率、高致殘率、高病死率給社會和家庭帶來沉重的負擔[3]。

缺血性卒中的病因主要是動脈粥樣硬化性腦血栓形成。血小板的活化與聚集在血栓形成的病理生理中起著重要的作用[4]。在急性腦梗死治療中，最有效的治療方法為超早期的溶栓治療[5]。但是溶栓治療因其時間窗短，禁忌證及出血、再灌注等并發癥相對較多，臨床工作中多難以實施，故抗血小板治療是繼溶栓治療外最有效的治療方式[3]，而在缺血性卒中的二級預防中，抗血小板治療的作用尤為重要[6]。

在抗血小板藥物的8個家族中，目前最廣泛應用于臨床的抗血小板藥物為阿司匹林及氯吡格雷。但有文獻報道：3%～85%服用阿司匹林及4%～30%服用氯吡格雷的患者[7-8]，即使長期規律服藥，仍有卒中復發的風險，臨床預后并沒有得到改善，這可能與患者對抗血小板藥物的反應性降低有關。有學者[9]將這種患者對抗血小板藥物反應性降低的現象，稱為“抵抗”。

有關“阿司匹林抵抗”及“氯吡格雷抵抗”發生的機制比較復雜，目前尚不十分明確，以往的研究提示抗血小板藥物代謝及作用過程中涉及的相關基因多態性可能是一個重要因素。本文將有關基因多態性與以上兩種抗血小板藥物的反應性最新臨床研究進展做一綜述，以期對臨床制訂個體化治療具有幫助。

2 抗血小板藥物——阿司匹林

2.1 阿司匹林的作用機制 阿司匹林口服后經胃腸道完全吸收，吸收后迅速降解為主要代謝產物水楊酸。兩者均和血漿蛋白緊密結合并迅速分布于全身。水楊酸主要經肝臟代謝排出。阿司匹林在血小板內通過與環氧合酶（cyclooxygenase，COX）活性部分絲氨酸殘基發生不可逆的乙酰化反應，使酶失活，抑制花生四烯酸（arachidonic acid，AA）的代謝，從而減少對血小板有強大促聚集作用血栓素A2（thromboxane A2，TXA2）的產生，抑制血小板聚集功能[10]。整個作用及代謝途徑中，血小板表面與阿司匹林代謝相關的ABC轉運蛋白家族的基因多態性、血小板激活途徑相關的COX、TXA2受體、血小板內皮聚集受體1（platelet endothelial aggregation receptor-1，PEAR1）、血小板糖蛋白（glycoprotein，GP）Ⅱb/Ⅲa、（GP）Ⅰa/Ⅱa受體基因的多態性，均可以直接影響阿司匹林的血小板抑制作用從而造成其抵抗（圖1）。

圖1 阿司匹林作用途徑

2.2 阿司匹林抵抗及其分型 “阿司匹林抵抗”是指經過規范的阿司匹林治療后未達到預期的生物學效應。Weber等[11]將阿司匹林抵抗分為三種類型。Ⅰ型抵抗（藥動學型）：增加阿司匹林劑量能夠抑制血小板聚集。對此型抵抗的一種可能解釋是，當給予小劑量阿司匹林時，存在顯著的個體內與個體間藥動學差異。患者的依從性差可能占此型抵抗病例中的大部分。Ⅱ型抵抗（藥效學型）：增加阿司匹林劑量也不能抑制血小板聚集。在這些患者中，阿司匹林與血小板COX之間的相互作用似乎受到了損害。Patrono等[12]認為COX基因的多態性是這部分患者阿司匹林抵抗的基因基礎。此型抵抗似乎是冠狀動脈旁路移植術后患者的主要抵抗類型。Ⅲ型抵抗（假性抵抗）：口服或體外條件下加入阿司匹林，均無法抑制這些患者膠原誘導的血小板聚集。在這些患者中，阿司匹林可以發揮其藥效學效應［抑制血小板血栓素（thromboxane，TX）生成］，但低濃度膠原并不依賴于TX放大路徑來誘導血小板聚集。Ⅲ型抵抗用血小板聚集試驗診斷具有一定的局限性。此型抵抗似乎是急性卒中患者的主要類型。2.3 基因多態性與阿司匹林抵抗

2.3.1 ABC轉運蛋白家族基因的多態性 ABC轉運蛋白家族是一大類依賴ATP的跨膜轉運蛋白，與體內多種物質的跨膜轉運有關。其與血小板內阿司匹林代謝有關的基因主要是ABCB1和ABCC4兩大類。

A B C B1基因又稱為多耐藥基因－1（multidrug resistance gene-1，MDR1/ABCB1），編碼一種較大的（170 kD）P糖蛋白，這種跨膜轉運蛋白對包括心臟病藥物、抗生素、類固醇等多種藥物的生物利用度有重要影響。有文獻提示，其多態性對口服抗血小板藥物如氯吡格雷的生物利用度有明顯影響，從而影響心血管患者的預后[13]。其基因多態性位點位于rs 1045642（C3435T），主要基因型分為TT、CC、CT三型。Sharma等[14]在對560例缺血性卒中病患者和同等健康志愿者對比的研究中發現，與CC基因型相比，TT基因型患者發生阿司匹林抵抗的風險明顯升高。即使在考慮了卒中亞型的影響后，這一結論仍然成立。但目前相關的研究資料還較少，需要進一步的大樣本研究證實。

ABCC4基因編碼多耐藥蛋白－4（multidrug resistance protein-4，MRP4/ABCC4），也是ABC轉運蛋白家族的重要成員，可將多種異質性及內生性有機陰離子泵出細胞外[15]。MRP4在人類血小板上有表達[16]，而同時已有研究證實阿司匹林作為一種弱酸性物質，可以作為MRP4的底物而被泵出血小板外。在一項體外研究中，對于健康人群血小板，阿司匹林對COX-1活性的影響與MRP4介導的阿司匹林轉運關系不大，但對于冠狀動脈旁路術后的患者，由于其血小板上存在MRP4的過表達，明顯影響了阿司匹林的藥理學活性[17]。常見的MRP4基因的變異位點包括T-1393C、C-1015T、C934A、A4131C等[18]。2009年的一項研究[18]證實，與其他基因型相比，C-1393突變可明顯增強啟動子活性，從而增加MRP4的表達。這可能是引起卒中患者阿司匹林抵抗的原因之一，但仍需進一步的體內研究證實。

2.3.2 環氧合酶基因的多態性 COX是阿司匹林抗血小板作用的靶點，有兩種亞型COX-1和COX-2。阿司匹林為非選擇性的COX抑制劑，對二者均有不可逆的抑制作用。但阿司匹林對COX-1的抑制作用是COX-2的170倍[19]。

作為阿司匹林的直接底物酶，COX-1的基因多態性可影響COX的蛋白結構或構象，使其對阿司匹林抑制作用的敏感性極不均一，構成一些患者阿司匹林抵抗的結構基礎。COX-1基因功能上類似于管家基因（housekeeping genes），且位于染色體9q32-33.3上，序列跨度為22 kb，有11個外顯子和10個內含子[20]。COX-1基因多態性與血小板對阿司匹林反應性的研究，經歷了漫長的過程。最初研究認為，處于編碼信號肽區域rs3842787（C50T）和另外一個A-842G組成的單體型與阿司匹林反應性相關聯[21]。然而，最近的發現研究COX-1基因位點與人種密切相關聯。Agndez等[22]認為，與阿司匹林抵抗關聯的基因多態性在歐洲人種是rs3842787和rs5789，在非洲人種中是rs3842789和rs3842792。由于rs3842787（50C＞T）等在亞洲人群中的次等位基因頻率均極低，從而認為rs3842787并不是主導亞洲人群阿司匹林抵抗的主要等位基因，這一結果已有實驗證據支持[23]。另一個位點rs1330344位于啟動區，突變基因導致COX-1表達上調[24]。李曉利等[25]的研究證明rs1330344（1676A/G）在中國人群出現頻率較高，可能與國人阿司匹林抵抗相關。

COX-2主要存在于血管內皮、單核細胞等有核細胞中，但在動脈粥樣硬化的慢性炎癥過程中，炎癥刺激因子可誘導并調節血循環中的相關細胞的COX-2表達，也可將AA轉化成前列腺素并被血小板攝入，并被血小板血栓素合成酶催化形成TXA2[26]。2002年COX-2啟動子區的rs20417（-765G/C）基因得到確認[27]，在一項有450例缺血性卒中患者和440例年齡和性別匹配的健康志愿者對比的研究[28]中發現，在CC、CG、GG三個基因型中，CC、CG與阿司匹林抵抗顯著相關。COX-2的rs20417（-765G/C）基因中的C等位基因可以顯著降低COX-2的活性，與老年缺血性卒中患者的阿司匹林抵抗相關。國內部分學者的研究[29]也證實了這一觀點。2.3.3 TXA2受體基因的多態性 在血小板聚集過程中，TXA2必須作用于相應的受體才能發揮其強大的促聚集作用，故TXA2受體的基因多態性也與阿司匹林治療的效果密切相關。TXA2受體基因位于染色體19p13.3上，序列跨度為15 kb，含4個外顯子[30]。2007年日本學者Fujiwara等[31]研究發現，TXA2受體等位基因924T＞C與健康日本人群的阿司匹林抵抗相關。中國學者Gao等[32]在262例不穩定冠狀動脈疾病患者中的研究也證實了這一點。目前，這方面還缺乏大規模的臨床資料，值得我們進一步深入研究。

2.3.4 PEAR1基因的多態性 2008年Herrera-Galeano等[33]對PEAR1基因多態性與阿司匹林反應性做了系統研究，通過對1486例健康志愿者基因的分析，發現rs2768759（A/C）中的C等位基因，與血小板聚集率升高相關，在服用阿司匹林后，這種相關性更強，且C等位基因與服用阿司匹林后產生血小板抵抗相關，增加剩余血小板的聚集率。2010年Kunicki等[34]對包括PEAR1在內的數十個血小板相關基因做了系統總結，PEAR1被認為可以同時調節CRP-XL和二磷酸腺苷（adenosine diphosphate，ADP）形成通路，其中CRP-XL通路與rs41299597位點相關，ADP通路與rs11264579相關，其基因多態性均可能影響阿司匹林的抗血小板作用。2013年Lewis等[35]研究發現，PEAR1的rs12041331基因多態性變化與患者的抗血小板治療反應性密切相關。其中，與GG純合子相比，無論是單用阿司匹林還是阿司匹林聯合氯吡格雷雙抗治療，A等位基因攜帶者的心血管事件風險及死亡率均明顯升高。

2.3.5 GP受體基因的多態性 GP受體為血小板聚集最終通路上的關鍵受體，分為GPⅡb/Ⅲa和GPⅠa/Ⅱa受體[36]。故GP的任何變化均會引起包括阿司匹林在內的各類抗血小板藥物反應性的變化。迄今已發現C157T、A1163C、A1553G、T1565C等多個GPⅢa受體多態性位點[37]，較為常見的是T1565C（Leu33Pro），編碼Leu的位點稱為PLA1（HPA21a），編碼Pro的位點稱為PLA2（HPA21b）。多個研究證實在阿司匹林抵抗患者中，PLA2等位基因的出現率明顯增高[38]。但研究者所用檢測阿司匹林反應性的指標各有不同，故所取得的結論也有所差異。2011年茅新蕾等[39]就阿司匹林抵抗和GPⅢa的基因多態性關系做了研究，但未發現兩者之間的關系。GPⅠa的基因編碼區有2個等位基因，即C807和T807。攜帶T807等位基因者血小板膜上的GPⅠa/Ⅱa受體密度增加，與Ⅰ型膠原的黏附快，而C807則相反。GPⅠa/Ⅱa受體密度增加可能是血栓形成的潛在危險因素和阿司匹林抵抗的原因[40]。國內的一項有200例存在動脈粥樣硬化高危因素的患者及100位健康志愿者參加的研究[41]也證實了GPⅠa的T807等位基因與阿司匹林抵抗密切相關。

3 抗血小板藥物——氯吡格雷

3.1 氯吡格雷的作用機制 氯吡格雷為前體藥物，在體內需經CYP450酶系統（主要是CYP3A4，CYP2C19編碼的酶）的作用轉化成活性代謝產物才能發揮抗血小板的作用。氯吡格雷經口服吸收進入人體后，在小腸吸收，吸收過程受到MDR1編碼的質子泵P糖蛋白的調節；吸收后在CYP450酶家族的作用下，在體內通過氧化、水解兩步連鎖反應，大部分（約85%）被轉化為無活性的代謝產物排出體外，約15%轉化為一種硫醇衍生物，此為活性代謝產物，選擇性地與血小板表面ADP受體P2Y12不可逆地結合（對P2Y1、P2Y13等其他受體無作用），減少ADP結合位點，阻斷ADP對腺苷環化酶的抑制作用，促進環磷酸腺苷（cyclic adenosine monophosphate，cAMP）依賴的舒血管物質磷酸蛋白的磷酸化，從而抑制纖維蛋白原與血小板糖蛋白GPⅡb/Ⅲa受體結合及繼發的ADP介導的糖蛋白GPⅡb/Ⅲa復合物的活化，進而抑制血小板的聚集[42-43]。Feher等[44]研究發現：氯吡格雷代謝酶（CYP450酶家族）的基因多態性、血小板激活途徑相關的P2Y12受體、GPⅡb/Ⅲa基因的多態性，可以直接影響氯吡格雷的血小板抑制作用從而造成其抵抗。

3.2 氯吡格雷抵抗及其分型 “氯吡格雷抵抗”是指經過規范的氯吡格雷治療后未達到預期的生物學效應。所謂“抵抗”，可以從兩個方面理解：①臨床抵抗：指盡管患者進行正規的抗血小板治療，仍有不良血管事件發生；②實驗室抵抗：指盡管患者規范地應用抗血小板藥物，通過實驗室檢測發現，血小板的活性沒有得到有效的抑制[45]。目前實驗室中多用檢測血小板聚集功能的方法來判斷是否有抵抗發生，但缺乏統一標準。值得關注的是，臨床抵抗和實驗室抵抗并不完全等同，臨床抵抗的患者并不一定具備實驗室抵抗，同樣，實驗室抵抗患者并不一定出現缺血事件，故不能單憑實驗室的檢測評估患者預后[46]。

3.3 基因多態性與氯吡格雷抵抗

3.3.1 P2Y12基因的多態性 血小板表面ADP是引起血小板聚集的最重要的物質，其作用是通過與血小板表面的ADP受體（P2Y1、P2Y12）相結合，活化血小板，并出現瀑布式連鎖反應，最終致血栓形成。氯吡格雷的活性代謝產物可選擇性地、不可逆地與血小板膜表面的ADP受體P2Y12結合，減少ADP結合位點，進而抑制血小板的聚集[47]。另外，氯吡格雷活性代謝產物，可通過促進P2Y12活性結構的改變來抑制P2Y12的活性，從而起到抑制血小板聚集的作用。因此，血小板激活途徑相關的P2Y12受體的基因多態性可以直接影響氯吡格雷的血小板抑制作用從而造成氯吡格雷抵抗的發生[48]。有文獻報道，H2單倍體（P2Y12 34C＞T TT）攜帶者易于發生動脈粥樣硬化性疾病，并且對氯吡格雷的治療反應性降低[49]。Fontana等[50]進行了一個病例對照研究，發現H2單倍體攜帶者與外周動脈疾病的發生有關。但此研究的受試對象是健康人群，未考慮有血栓基礎的患者。Von Beckerath等[51]對416例即將接受支架植入術的冠狀動脈性心臟病患者研究發現，與其他純合子相比，H2單倍體攜帶者接受高負荷量氯吡格雷（600 mg）治療后，ADP誘導的血小板聚集率變化無明顯差異。部分研究發現，氯吡格雷的抗血小板作用有時間相關性，隨著治療時間的延長，曾有氯吡格雷抵抗患者的抗血小板作用會有所改善[52]。但在新發表的一項研究中[53]，部分患者即使調整劑量也不能提高氯吡格雷的療效。多個研究均提示P2Y12基因多態性對氯吡格雷的影響目前尚存在爭議，氯吡格雷抗血小板作用是否與劑量相關，是否如部分文獻報道氯吡格雷的抗血小板作用有時間及劑量的依賴性，目前仍需進一步證實。

3.3.2 CYP450系統基因的多態性 CYP450酶系統為氯吡格雷代謝中的關鍵酶，相關基因主要為CYP2C19及CYP3A4。

3.3.2.1 CYP3A4的基因多態性 氯吡格雷需經肝臟P450 3A4和3A5酶氧化后方有抗血小板活性，而起主要作用的是CYP3A4編碼的酶。編碼該酶的基因CYP3A4位于染色體7q21.3-22.1，其由27 000個堿基構成，結構包含13個外顯子和12個內含子[54]。目前已知的有30多個CYP3A4的單核苷酸多態性的位點。Angiollo等[55]在對CYP3A4的4個易感位點的基因頻率的研究中，發現有3個單核苷酸多態性位點存在不平衡連鎖現象，在所研究人群中，4個單核苷酸多態性位點組成了3種常見的單體型，即IVS7+258A＞G，IVS10+12G＞A，IVS7+894C＞T，其中攜帶IVS10+12G＞A的患者對氯吡格雷敏感，但未發現其他幾個單核苷酸多態性位點與氯吡格雷抵抗是否相關。在一個對300例行冠狀動脈介入的患者的CYP3A4 894C＞T位點分析研究中，發現該位點存在基因多態性，分別為TT、CT、CC型，結果表明該位點基因多態性與氯吡格雷抵抗的發生相關[56]，認為攜帶TT及CT的患者不容易發生氯吡格雷抵抗。但Fontana等[57]對健康志愿者和經皮冠狀動脈介入治療（percutaneous coronary intervention，PCI）患者進行CYP3A4基因多態性研究后分析表明CYP3A4基因多態性可能與氯吡格雷抵抗無關。以上研究表明，CYP3A4的基因多態性對氯吡格雷抵抗的發生是否有相關性，目前也尚無定論，仍需進一步研究。

3.3.2.2 CYP2C19的基因多態性 CYP2C19編碼的酶為CYP450酶系統中另一重要的成員，此酶在氯吡格雷的代謝中起著最為重要的作用[58]。CYP2C19定位于10q24.1-q24.3染色體，編碼CYP450酶家族，參與藥物代謝及酯化反應。CYP2C19由490個氨基酸組成，分子量為55 933，其全部順序包括9個外顯子和5個內含子[59]。CYP2C19酶廣泛存在于肝臟、腎臟、腦、皮膚、肺、胃腸道及胎盤等組織器官，主要存在于肝臟。

CYP2C19酶蛋白在氯吡格雷的代謝活化中起主要作用，編碼該酶蛋白的基因CYP2C19在人體中呈多態性表達，在亞洲人群中，最常見的基因型為和其中被證實為最主要的無功能等位基因。其中被定義為快代謝型（extensive metabolism，EM）；攜帶一種無功能等位基因或被定義為中間代謝型（intermediate metabolism，IM）；而攜帶兩種無功能等位基因被定義為慢代謝型（poor metabolism，PM）。

在目前研究的CYP2C19基因多態性與氯吡格雷代謝作用的關系中，認為CYP2C19、CYP2C19和CYP2C19等位基因與氯吡格雷抵抗有關[60]，而攜帶CYP2C19野生基因型（）的患者服用氯吡格雷后能夠較好地抑制血小板活性，攜帶無功能基因型（）的患者更容易出現氯吡格雷抵抗[61-62]。表明氯吡格雷對血小板抑制作用的個體差異可能與CYP2C19的基因多態性有關，Jia等研究[63]也證實攜帶CYP2C19/的急性缺血性卒中患者對氯吡格雷的反應性較好，3個月和6個月后預后明顯好于中間代謝和慢代謝型患者。且攜帶無功能基因型（）的患者卒中復發多于快代謝型患者。

4 小結

綜上所述，藥物代謝及作用過程中相關的基因多態性，與抗血小板藥物抵抗具有相關性，目前較多的研究集中在急性冠狀動脈綜合征、經皮冠狀動脈介入術后等心血管疾病以及健康人群，而在腦梗死患者方面的研究相對較少。

腦梗死的抗血小板聚集的個體化治療將是今后腦梗死治療及二級預防發展的趨勢，隨著分子生物學的發展，基因檢測可能為抗血小板治療藥物的選擇提供新的依據，給腦梗死治療帶來新的突破。

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【點睛】

從基因多態性的角度闡述抗血小板藥物阿司匹林和氯吡格雷抵抗的可能機制，指導臨床個體化治療。