金銀花體外抗流感病毒細胞代謝成分研究

郭承軍，張會敏

（1.山東省運動康復研究中心，山東濟南250102；2.山東省中醫(yī)藥研究院，山東濟南250014）

金銀花體外抗流感病毒細胞代謝成分研究

郭承軍1，張會敏2

（1.山東省運動康復研究中心，山東濟南250102；2.山東省中醫(yī)藥研究院，山東濟南250014）

目的考察金銀花藥物成分經正常細胞及感染流感病毒細胞代謝后，金銀花主要成分的變化情況。方法應用中藥指紋圖譜技術，將得到的色譜圖導入指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)進行分析，比較各組間的標準指紋圖譜主要特征色譜峰，找出與金銀花抗流感作用相關的差異色譜峰。結果以培養(yǎng)基空白組為對照，正常細胞給藥組、病毒細胞給藥組各主要特征峰的峰面積表現(xiàn)出整體下降趨勢。8號峰面積明顯下降，2號峰、7號峰與c號峰與培養(yǎng)基空白組及金銀花對照藥材比較，相對峰面積成倍增加。結論2、7、8、c號峰對應的化合物可能與金銀花抗流感病毒活性密切相關。

金銀花；抗病毒；細胞代謝

流感病毒具有病毒典型特征：自身無完整的酶系統(tǒng)，無法自我復制，必須借助宿主細胞的酶系統(tǒng)才能完成整個生命周期。具有抗流感病毒作用的藥物通過阻斷病毒繁殖過程的吸附、穿入、復制、成熟中的某一環(huán)節(jié)，繼而殺滅病毒或抑制病毒復制，從而達到抗病毒的目的［1］。多年來，本課題組一直致力于中藥抗流感病毒的體內外的實驗研究，本文應用指紋圖譜技術，考察金銀花藥物成分經正常細胞及感染流感病毒細胞代謝后，金銀花主要成分的變化情況，為金銀花抗流感病毒的物質基礎及作用機理的闡明提供依據(jù)。

1 實驗材料與儀器

1.1 儀器 Agilent1100 LC高效液相色譜儀（美國安捷倫公司，二極管陣列DAD檢測器）；Venusil XBP－C18（4.6 mm×250 mm，5μm）色譜柱；CO2恒溫培養(yǎng)箱（美國FOMAS公司）；－80℃冰箱（美國FOMAS公司）；恒溫培養(yǎng)箱；倒置顯微鏡；凈化工作臺等。

1.2 試劑 乙腈（色譜純，天津四友生物醫(yī)學技術有限公司），甲醇（色譜純，天津四友生物醫(yī)學技術有限公司），其他所用試劑為分析純。綠原酸對照品（中國藥品生物制品檢定所；批號：110753－200413），DMEM細胞培養(yǎng)液（美國Gibco公司產品，含10%新生牛血清），DMEM細胞維持液（美國Gibco公司產品，含2%新生牛血清），pH 7.4的磷酸鹽緩沖液（PBS），0.25%胰酶。

1.3 實驗材料 金銀花（產地：山東平邑）；流感病毒甲型（1995.AII：32094），引自中國疾病預防控制中心病毒病預防控制所毒種室；MDCK（狗腎細胞系，為流感病毒宿主細胞株），引自中國疾病預防控制中心病毒病預防控制所流感病毒研究室。

2 實驗內容及方法

2.1 提取物的制備 金銀花提取物由本實驗制備，病毒增殖、病毒對細胞的毒力測定、藥物細胞毒性試驗等試驗方法參見本項目組已發(fā)表論文［2］。

2.2 MDCK細胞代謝后供試品的制備 將已長成單層MDCK細胞的培養(yǎng)瓶，分成正常細胞給藥組、空白組，病毒細胞給藥組、空白組，共4組，每組3個。每瓶加入DMEM細胞維持液100mL，病毒細胞給藥組、空白組分別加入流感病毒甲型貯備液15 mL，正常細胞給藥組、病毒細胞給藥組分別加入金銀花提取物0.5 mL，混勻，即得。

培養(yǎng)基空白對照組：取3個與上述規(guī)格相同但未接種細胞的無菌培養(yǎng)瓶，每瓶加入DMEM細胞維持液100 mL，金銀花提取物0.5 mL，混勻，即得。

將各培養(yǎng)瓶置37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72 h，取出，倒置顯微鏡下觀察：病毒細胞空白組細胞脹大、胞內容物增多，破碎，出現(xiàn)大面積的空腔，細胞病變率超過90%；正常細胞空白組細胞生長良好、排列整齊，其他各組細胞形態(tài)基本保持完好。

取各培養(yǎng)基液、破碎細胞液，分別于攪拌下緩慢加入5倍量的甲醇，冷藏放置4 h，濾過，濾液蒸干，殘渣加甲醇5 mL使溶解，用0.45μm微孔濾膜濾過，即得。

2.3 對照品、對照藥材溶液的制備 綠原酸對照品溶液精密稱取綠原酸對照品適量，加甲醇制成約40 μg·mL－1的溶液，即得。

金銀花對照藥材溶液 取金銀花對照藥材提取物0.5 mL，加甲醇至5 mL，搖勻，冷藏放置4 h，用0.45μm微孔濾膜濾過，即得。

2.4 色譜條件及系統(tǒng)適應性試驗 用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；乙腈－0.4%磷酸－水為流動相，按表1進行梯度洗脫；檢測波長為238 nm；柱溫：30℃；流速：1 mL·min－1。理論板數(shù)按綠原酸峰計算應不低于2 000。

表1 梯度洗脫條件

2.5 測定及圖譜處理 照高效液相色譜法［《中國藥典》2010年版（一部）附錄ⅥD］，依法測定。將得到的色譜圖導入指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)進行分析，比較各組間的標準指紋圖譜主要特征色譜峰，找出與金銀花抗流感作用相關的差異色譜峰。

3 結果

3.1 培養(yǎng)基中金銀花代謝成分指紋圖譜 同組內不同供試品的藥物成分指紋圖譜相似均能達到0.9以上。不同組之間的相關成分峰對位匹配如圖1。經比較分析剔除正常細胞空白組干擾色譜峰之后，金銀花相關成分峰的色譜峰數(shù)據(jù)如表2。

圖1 各組培養(yǎng)基金銀花相關成分峰對位匹配圖

表2 各組培養(yǎng)基中金銀花相關成分峰數(shù)據(jù)表

續(xù)表2：

3.2 細胞內金銀花代謝成分指紋圖譜 從各組細胞內指紋圖譜檢測的結果可以看出，金銀花指紋圖譜所能顯示出的化學成分進入細胞的極少。不同組之間細胞內金銀花代謝成分指紋圖譜匹配，如圖2。相關色譜峰數(shù)據(jù)見表3。

圖2 各組細胞內金銀花相關成分峰對位匹配圖

表3 各組細胞內相關成分峰數(shù)據(jù)表

4 小結與討論

4.1 本實驗的研究結果表明：正常細胞空白組培養(yǎng)基及細胞內所含成分對金銀花指紋圖譜分析無明顯干擾。以培養(yǎng)基空白組為對照，正常細胞給藥組、病毒細胞給藥組各主要特征峰的峰面積表現(xiàn)出整體下降趨勢。8號峰是金銀花藥材指紋圖譜中的主要的特征峰之一，在空白培養(yǎng)基組中即明顯下降，說明其降低與培養(yǎng)基密切相關，雖然正常細胞給藥組仍可檢出，但病毒細胞給藥組未能檢出，說明此成分與流感病毒有一定關系；另外9號峰、10號峰在培養(yǎng)基空白組可檢出，而正常細胞給藥組和病毒細胞給藥組未檢出，分析9、10號峰對應的成分與細胞代謝有關，而與抗流感病毒活性關系不大；2號峰、7號峰與c號峰與培養(yǎng)基空白組及金銀花對照藥材比較，相對峰面積成倍增加，這幾個化合物可能與金銀花抗流感病毒活性密切相關。

4.2 細胞內金銀花代謝成分指紋圖譜結果顯示：1號峰為MDCK細胞自身含有的成分，2號、3號、5號峰分別為金銀花指紋圖譜中的第3、4（S）、7號共有特征指紋峰，有少量轉入細胞內，可發(fā)揮細胞內的抗病毒作用，但病毒細胞組未檢出此3個化合物峰，卻在25 min左右檢出一未知峰，是否屬于病毒或由病毒感染后的細胞生成的新次生代謝產物，值得進一步研究。

［1］王雪，楊巧麗，史玉柱，等.中藥抗流感病毒作用及機制的研究概況［J］.中國醫(yī)藥導報，2012，9（33）：27－29.

［2］石俊英，郭承軍.金銀花體外抗流感病毒有效部位研究［J］.山東中醫(yī)藥大學學報，2010，34（2）：178－180.

Study on the com ponents of cellmetabolism of Flos Lonicerae anti－influenza virus in vitro

GUO Cheng-jun1，ZHANG Hui-min2
（1.Athlete Rehabilitation Center of Shandong Province，Jinan 250102，China；2.Shandong Academy of TCM，Jinan 250014，China）

ObjectiveTo investigate themain composition changes of Fols lonicerae through themetabolism of normal cells and cells infectedby influenza virus.MethodsApplied with the fingerprint technology，and imported the obtained chromatograms into fingerprint similarity evaluation system component，and analyzed.Compared the main characteristic peaks of the standard fingerprints among groups to find out the different chromatographic peaks related to the effect of Flos lonicerae anti－influenza.ResultsThe blank group as control，themain characteristic peaks area of the normal cells group and cells group infected by virus showed a general downward trend.Compared with blank group and the controlmedicine Flos Lonicerae，No.8 peak area decreased significantly，No.2，No.7 peak and peak c，relative peak area multiplied.ConclusionThe compounds of2，7，8，c peaks correspondingmay be closely related to the anti－influenza virus activity of Flos lonicerae.

Flos lonicerae；Antiviral；Cellmetabolism

R285

：A

2095－5375（2014）07－0376－003

山東省中醫(yī)藥科技發(fā)展計劃項目（No.2011－162）；山東省自然科學基金項目（No.Y2007C177）

郭承軍，男，博士研究生，副主任中藥師，研究方向：運動損傷治療的中藥新藥，E－mail：guochj28＠126.com

張會敏，女，博士研究生，助理研究員，研究方向：中藥化學、中藥炮制及中藥質量標準，Tel：0531－82949830，E－mail：huiminzhang＠163.com