基因工程菌發(fā)酵表達rhG－CSF的條件優(yōu)化

王 娟，李希平

（魯南制藥集團股份有限公司，山東臨沂273400）

·工業(yè)藥學·

基因工程菌發(fā)酵表達rhG－CSF的條件優(yōu)化

王 娟，李希平

（魯南制藥集團股份有限公司，山東臨沂273400）

目的通過優(yōu)化基因工程菌Escherichia coli BL21（DE3）Plys表達重組人粒細胞集落刺激因子（rhGCSF）蛋白的發(fā)酵工藝，提高蛋白產量。方法以100 L規(guī)模發(fā)酵為例，從不同的接種量（1%～10%）、加入IPTG進行誘導時的不同OD600nm值，誘導表達后的不同溶氧可控制范圍（20%～80%）等方面進行優(yōu)化。用SDS－PAGE對蛋白表達量進行檢測。結果優(yōu)化后的方案為：采用5%的接種量，在OD600nm達到10～15時加入誘導劑IPTG，誘導起始后前20 min控制溶氧在80%以下，20 min后通過補加氨水控制pH在7.0左右，補料調節(jié)控制溶氧在20%～40%的范圍內，誘導表達5 h后收集菌體。優(yōu)化后的發(fā)酵方案極大提高了蛋白表達量。結論rhG－CSF蛋白發(fā)酵方案的優(yōu)化對大規(guī)模生產具有重要的指導意義。

重組人粒細胞集落刺激因子；發(fā)酵；溶氧；基因工程菌

20世紀基因工程技術誕生以來，應用最為廣泛的便是醫(yī)藥科學領域。基因工程技術的快速發(fā)展，使人們能夠快速有效的獲取大量的生物活性物質，能夠帶來巨大社會和經濟效益［1］。利用基因重組技術生產的人粒細胞集落刺激因子（rhG－CSF）與天然產品相比，生物活性在體內、外基本一致［2］。G－CSF是調節(jié)骨髓中粒系造血的主要細胞因子之一，可選擇性地作用于粒系造血細胞，促進其增殖、分化，并可增加粒系終末分化細胞即分周血中性粒細胞的數目與功能，適用于癌癥化療、放療等原因導致的中性粒細胞減少癥［2～5］。但基因工程發(fā)酵在應用于大規(guī)模生產的過程中，卻往往存在許多例如質粒丟失嚴重，表達量低等問題。在大規(guī)模生產中必須避免這些不穩(wěn)定因素［6］。本文從控制發(fā)酵過程中的接種量，IPTG誘導時機、pH、溶氧等簡易可控因素出發(fā)，篩選出維持rhG－CSF蛋白以100 L規(guī)模發(fā)酵表達的穩(wěn)定性方案。

1 材料與方法

1.1 材料 插入質粒pET3a（轉入人源G－CSF基因）的基因工程菌E.coli BL21（DE3）PlysS購自重慶富進生物醫(yī)藥有限公司；異丙基硫代半乳糖苷（IPTG）購自Merk公司；Yeast extract、Tryptone購自Oxoid公司；M9培養(yǎng)基及葡萄糖購自國藥公司。30 L－150 L 2聯體發(fā)酵罐購自上海高機生物公司。

1.2 方法 甘油菌株于Kan抗性LB平板劃線，37℃培養(yǎng)16～18 h，挑取規(guī)則的單菌落轉接入種子瓶37℃培養(yǎng)6～8 h至OD600nm到0.5～1.0之間。10%接種量轉入裝有100 LM9培養(yǎng)基的發(fā)酵罐，37℃恒溫通過恒速補料葡萄糖3 g·（L·h）－1培養(yǎng)5 h后，加1 mmol·L－1IPTG誘導蛋白表達，并停止補加葡萄糖20 min，繼續(xù)誘導培養(yǎng)5 h后，下罐收集菌體，破碎，進行純化，SDS－PAGE檢測蛋白表達和得率。

1.3 蛋白灰度分析 對SDS－PAGE電泳檢測后的蛋白凝膠進行掃描，Bandscan分析，計算目的蛋白在總蛋白中所占百分比。

1.4 質粒丟失率計算 發(fā)酵結束時的菌液稀釋涂布LB平板，37℃培養(yǎng)過夜，每個平板用牙簽挑取100個菌落，影印至含Kan抗性的LB平板和普通LB平板，37℃培養(yǎng)過夜，抗性板菌落對比普通板菌落計算得出質粒丟失率。

1.5 優(yōu)化方法［2～10］實驗分別從誘導時機、接種量、誘導起始期及誘導后的參數控制等方面多次進行100 L規(guī)模的實驗優(yōu)化。

2 結果

2.1 誘導表達的時機選擇 以接種培養(yǎng)后菌懸液的OD600nm為標準，設定5～10、10～15、15～20三個范圍確定最佳誘導時機。實驗結果表明在OD600nm為10～15時，加入IPTG開始誘導，最后的蛋白表達水平最高，SDS－PAGE蛋白電泳凝膠的Bandscan分析顯示，蛋白灰度百分比可高達43.0 %（見表1）。而若當OD600nm達5～10或15～20時進行誘導表達，最后的蛋白灰度百分比僅分別達37.6%及14.3%。

圖1 SDS－PAGE檢測rhG－CSF在E.coli BL21（DE3）PLysS中的表達水平

表1 目的蛋白灰度對比（%）

2.2 接種量優(yōu)化 實驗設計以1%、3%、5%、8%和10%的接種量對比，進行優(yōu)化。結果表明采用1%和3%接種量時，達到OD600nm10～15需要6～8 h，而采用5%～10%接種量時達到最佳誘導時機所需要的時間為4～5.5 h；而且蛋白分析數據顯示在5%接種量時，細菌最后表達目的蛋白的比例最高，其蛋白灰度百分比為43.2%（見圖1、表1）。因此最終確定5%接種量為最佳。

2.3 誘導期優(yōu)化 IPTG誘導蛋白表達的過程中，為避免補加葡萄糖對蛋白表達的抑制作用，在誘導期間停止補加葡萄糖20 min。在此期間我們通過調整轉速以及通入氧氣的量，改變發(fā)酵液溶氧量進行優(yōu)化。最后的質粒穩(wěn)定性（按國家藥典檢測方法獲取質粒的丟失率）測定結果表明誘導期維持溶氧在80%以下為更佳（見表2）。

表2 不同溶氧質粒丟失率

誘導后，采取補料培養(yǎng)的生長方式。我們對補料速度進行了優(yōu)化。根據罐體溶氧以及pH的變化，調控補料速度；在發(fā)酵罐維持恒定轉速（200 rpm）和恒定通氣量（0.3 m3·h－1）時，通過補加氨水的方式控制菌液pH在7.0左右，調控補料速度以維持溶氧分別在20%～40%、40%～60%及60%～80%的范圍。誘導5 h后收集菌液，SDSPAGE電泳檢測蛋白的表達并且對包涵體收率進行分析。實驗數據和結果表明溶氧控制在20%～40%之間，目的蛋白的表達效果最好（圖2、表3、4）。

表3 不同溶氧范圍包涵體收率

圖2 SDS－PAGE檢測rhG－CSF在E.coli BL21（DE3）PLysS中的表達水平

表4 目的蛋白灰度對比（%）

3 討論

利用基因重組技術進行工業(yè)化生產人粒細胞集落刺激因子rhG－CSF已經備受關注，我們通過多次重復實驗得到較優(yōu)的發(fā)酵條件，實現了rhG－CSF蛋白的高效穩(wěn)定表達，同時為向更大規(guī)模的生產提供了可靠的數據方案，具有重要的理論及應用價值。

在蛋白的發(fā)酵生產工藝中，接種量及蛋白表達的誘導時機對產量具有重要的影響，以我們的發(fā)酵為例，100 L培養(yǎng)基的接種量為10%，雖然縮短了誘導前的培養(yǎng)時間，也從而縮短整個發(fā)酵周期，但如此操作，菌種在前期生長過程中會產生許多不利于菌體生長和蛋白表達的因子，反而抑制了菌種后期目的蛋白的表達；以接種后補料培養(yǎng)時間作為標準確定蛋白誘導起始時間，由于多種不確定的影響因素，可重復性、參考性較差，故本論文優(yōu)化過程中以OD600nm為標準，大大增強其參考價值。

另外，基因工程菌的部分菌株在誘導表達前會有一定的本底表達［11］，而表達產物大部分對菌株都是有害的，這不利于菌株后期的生長及蛋白的表達。在100 L實際發(fā)酵表達中，由于生長條件如攪拌、通氣等的變化，也會影響誘導前的本底表達。我們在發(fā)酵過程中采用的是恒定補料的培養(yǎng)方式，補料培養(yǎng)基是以一定的C／N配制而成的，碳源的主要成分是葡萄糖，氮源則是酵母提取物與蛋白胨按照比例混合而成。通過在種子中增加相應的葡萄糖，發(fā)酵中通過pH以及溶氧的參數反饋，在菌體起始生長階段以稍過量的葡萄糖補料抑制本底表達，但是如果補料速度過快，葡萄糖濃度過高會造成過量的乙酸形成，導致pH迅速下降，溶氧迅速下降，抑制蛋白表達；故在誘導起始時需通過間歇停止補糖解除對蛋白表達的抑制作用；另外如果補料停止，攪拌和通氣卻仍然維持，就會造成碳源不足，pH、溶氧上升并維持在高位100 %以上，菌體生長趨于利用氮源，亦不利于質粒的穩(wěn)定及目的蛋白的表達和積累［12］。

發(fā)酵過程中，為了維持罐體內的溶氧范圍同時避免罐體壓力泄露造成染菌，一般維持罐內壓力在0.05～0.1 MPa之間。但是這同時增加了罐體內其他氣體的分壓，例如CO2，高溶解CO2不利于后期的表達［13］。因此在誘導前維持較高的罐壓，可以避免接種后延滯期染菌，同時較高溶解CO2抑制菌株的本底表達；而誘導過程中，將罐壓降至0.02 MPa左右，結合其他因素的控制可提高目的蛋白的表達。

據鄭劍等［14］的研究，用甘油做培養(yǎng)基能夠避免葡萄糖對細菌蛋白表達的抑制作用，提高總體菌體量，并增加所有蛋白的表達。而乳糖可起到相應的誘導作用又可促進后期菌體的生長及目的蛋白的表達，也可作為一種備選碳源。此外，可溶性表達也是蛋白表達的一個重要研究方向［15］。

總之，rhG－CSF蛋白的發(fā)酵工藝還有很大優(yōu)化的潛能，還有許多問題值得思考。

［1］熊宗貴.生物技術制藥［M］.北京：中國高等教育出版社，1999：65－109.

［2］Krishna Rao DV，Ramu CT，Rao JV，et al.Impact of dissolved oxygen concentration on some key parameters and production of rhG－CSF in batch fermentation［J］.J Ind Microbiol Biotechnol，2008，35（9）：991－1000.

［3］Khalilzadeh R，Mohammadian－Mosaabadi J，Bahrami A，et al.Process development for production of human granulocyte－colony stimulating factor by high cell density cultivation of recombinant Escherichia coli［J］.J Ind Microbiol Biotechnol，2008，35（12）：1643－1650.

［4］Yim S，Jeong K，Chang H，et al.High－level secretory production of human granulocyte－colony stimulating factor by fed－batch culture of recombinant Escherichia coli［J］.Bioprocess Biosyst Eng，2001，24（4）：249－254.

［5］Das KM，Banerjee S，Shekhar N，et al.Cloning，soluble expression and purification of high yield recombinant hGMCSF in Escherichia coli［J］.Int JMol Sci，2011，12（3）：2064－2076.

［6］Babaeipour V，Abbas MP，Sahebnazar Z，et al.Enhancement of human granulocyte－colony stimulating factor production in recombinant E.coli using batch cultivation［J］.Bioprocess Biosyst Eng，2010，33（5）：591－598.

［7］李民，陳常慶.重組大腸桿菌高密度發(fā)酵研究進展［J］.生物工程進展，2000，20（2）：26－31.

［8］劉社際，楊立明.重組人生長激素在大腸桿菌BL21（DE3）中高效表達研究［J］.生物技術通訊，2000，11（4）：264－267.

［9］楊煒，王偉剛，田海英，等.重組大腸桿菌高表達高密度發(fā)酵研究［J］.生物技術，2006，16（3）：83－86

［10］薛文嬌.重組E.coli生產類人膠原蛋白發(fā)酵調控策略與500L中試規(guī)模放大方法優(yōu)化［D］.西北大學，2009.

［11］李會成，李文輝.基因工程菌的發(fā)酵研究［J］.生物工程進展，1997，17（2）：40－43.

［12］kesson M，Hagander P，Axelsson JP.A probing feeding strategy for Escherichia coli cultures［J］.Biotechnology Techniques，1999，13（8）：523－528.

［13］Pan JG，Rhee JS，Lebeault JM.Physiological constraints in increasing biomass concentration of Escherichia coli B in fed－batch culture［J］.Biotechnol Lett，1987，9（2）：89－94.

［14］鄭劍，吳琳琳，李敏.乳糖誘導高分子量重組蛛絲蛋白發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)化［J］.中國生物工程雜志，2008，28（12）：41－46.

［15］Zhu F，Wang Q，Pu H，et al.Optimization of soluble human interferon－γproduction in Escherichia coli using SUMO fusion partner［J］.World JMicrobiol Biotechnol，2013，29（2）：319－325.

Optim ization of the fermentation of rhG－CSF using recom bined strain

WANG Juan，LIXi-ping
（Lunan Pharmaceutical Group Corporation，Linyi273400，China）

ObjectiveTo improve the rhG－CSF protein from the recombined strain Escherichia coli BL21（DE3）Plys，the batch fermentation conditions was optimesed.MethodsWe determined the influence of the parameters at some crucial control points，including different inoculation amount（1%～10%），the OD600nmof fermentation culturewhen adding inducer IPTG and the different concentrations of dissolved oxygen（DO）（20%～80%）on the final protein expression in 100 L batch level fermentation.A SDS－PAGEwas used to analyze the protein expression.ResultsThe optimized fermentation condition was as follow：inoculum quantity 5%，IPTG should be added when the OD600nmof culture reaches10～15，at the beginning of inducing the expression of object protein，the DO concentration was controlled under 80%；After inducing 20 min，the pH ofmedium was kept at around 7.0 by adding ammonia，the DO concentration was keptat20%～40%；The bacteria was collected after inducing 5 hours.The production of rhG－CSFwas higher after optimizing the fermentation conditions.ConclusionThe optimized fermentation conditions for rhG－CSF production in E.coli BL21（DE3）Plys provided import direction for its large scale preparation.

rhG－CSF；Fermentation；Dissolved oxygen；Genetic engineered stains

Q812

：A

2095－5375（2014）07－0428－003

王娟，女，研究方向：基因工程菌的發(fā)酵表達與工業(yè)化，E－mail：tuky2003＠163.com