莫匹羅星軟膏微生物限度檢查的方法學驗證

楊育林，吉瑩潔

（洛陽市食品藥品檢驗所，河南洛陽471023）

莫匹羅星軟膏微生物限度檢查的方法學驗證

楊育林，吉瑩潔

（洛陽市食品藥品檢驗所，河南洛陽471023）

目的建立莫匹羅星軟膏的微生物限度檢查方法。方法依據(jù)《中國藥典》2010年版規(guī)定，采用常規(guī)法、培養(yǎng)基稀釋法、薄膜過濾法進行方法驗證。結(jié)果莫匹羅星軟膏具有明顯的抑菌活性。其微生物限度檢查的細菌計數(shù)宜采用薄膜過濾法，真菌及酵母菌計數(shù)采用常規(guī)法；控制菌檢查中的金黃色葡萄球菌宜采用薄膜過濾法，銅綠假單胞菌采用常規(guī)法。結(jié)論確立了莫匹羅星軟膏的微生物限度檢查方法，可有效控制其質(zhì)量。

莫匹羅星軟膏；微生物限度檢查；方法驗證

微生物限度檢查是反映藥品安全性的重要指標之一，《中國藥典》明確規(guī)定，當建立藥品的微生物限度檢查法時，應(yīng)進行方法驗證［1］。驗證的目的是確認所采用的方法是否適合于供試品的微生物限度檢查。根據(jù)檢查方法的不同，又分為細菌、真菌及酵母菌計數(shù)方法的驗證和控制菌檢查法的驗證。莫匹羅星軟膏為局部外用抗生素，適用于革蘭陽性球菌引起的皮膚感染，因其具有抑菌活性，若不經(jīng)方法學驗證，難以保證所采用的方法適合該供試品的微生物限度檢查，可能影響檢驗結(jié)果的準確、可靠及檢驗方法的完整性。故本文參考相關(guān)資料［2～7］，對其微生物限度檢查方法進行考察，為以后檢驗提供依據(jù)。

1 材料

1.1 供試品 莫匹羅星軟膏（中美天津史克制藥有限公司，批號：12080735）。

1.2 菌種 大腸埃希菌［CMCC（B）44 102］、金黃色葡萄球菌［CMCC（B）26 003］、枯草芽孢桿菌［CMCC（B）63 501］、銅綠假單胞菌［CMCC（B）10 104］、白色念珠菌［CMCC（F）98 001］、黑曲霉菌［CMCC（F）98 003］均由河南省食品藥品檢驗所提供。

1.3 培養(yǎng)基和稀釋液 所用培養(yǎng)基均由北京三藥科技開發(fā)公司生產(chǎn)；0.9%無菌氯化鈉溶液、pH 7.0無菌氯化鈉－蛋白胨緩沖液由本所配制。

2 試驗部分

2.1 菌液制備

2.1.1 接種金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、大腸埃希菌、與枯草芽孢桿菌的新鮮培養(yǎng)物于營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中，35℃培養(yǎng)18～24 h，用0.9%無菌氯化鈉溶液稀釋制成50～100 CFU·mL－1的菌懸液。

2.1.2 接種白色念珠菌的新鮮培養(yǎng)物至改良馬丁培養(yǎng)基中，25℃培養(yǎng)24～48 h，用0.9%無菌氯化鈉溶液稀釋制成50～100 CFU·mL－1的菌懸液。

2.1.3 接種黑曲霉的新鮮培養(yǎng)物至改良馬丁瓊脂斜面培養(yǎng)基上，25℃培養(yǎng)一周，加入3～5 mL含0.05%（V／V）聚山梨酯80的0.9%無菌氯化鈉溶液，將孢子洗脫，吸出孢子菌液至滅菌試管內(nèi)，用含0.05%（V／V）聚山梨酯80的0.9%無菌氯化鈉溶液稀釋制成50～100 CFU·mL－1的孢子懸液。

2.2 供試液制備 取供試品10 g，加45℃恒溫的pH 7.0無菌氯化鈉－蛋白胨緩沖液100 mL，振搖使全部溶解，制成1∶10的供試液。

3 細菌、真菌及酵母菌計數(shù)方法驗證

3.1 試驗組

3.1.1 常規(guī)法 取1∶10供試液1 mL注入平皿，分別接種金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、枯草芽孢桿、白色念珠菌和黑曲霉孢子懸液各1 mL，立即傾注15～20 mL相應(yīng)培養(yǎng)基，平行制備兩個平皿，待凝固后置規(guī)定溫度培養(yǎng)至規(guī)定時間，觀察結(jié)果。

3.1.2 培養(yǎng)基稀釋法 取0.2 mL／皿的供試液，分別人工接種上述試驗菌懸液1 mL，立即傾注15～20 mL相應(yīng)培養(yǎng)基培養(yǎng)，待凝固后置規(guī)定溫度培養(yǎng)至規(guī)定時間，觀察結(jié)果。

3.1.3 薄膜過濾法 取1∶10的供試液1 mL，加至pH 7.0無菌氯化鈉－蛋白胨緩沖液100 mL中，照薄膜過濾法過濾后，用pH 7.0無菌氯化鈉－蛋白胨緩沖液沖洗濾膜5次，每次100 mL，在最后一次沖洗液中加入試驗菌懸液1 mL，濾干，取出薄膜菌面朝上貼于相應(yīng)培養(yǎng)基上，規(guī)定溫度培養(yǎng)至規(guī)定時間，觀察結(jié)果。

3.2 菌液組 按試驗組各方法不加供試液操作，測定所加菌數(shù)。

3.3 供試品對照組 取供試液1 mL，按試驗組操作，不加菌液，記錄菌落數(shù)。

3.4 稀釋劑對照組 取稀釋液1 mL代替供試液，按試驗組操作，記錄菌落數(shù)。

3.5 回收率計算 試驗組的菌回收率（%）＝（試驗組平均菌落數(shù)－供試品對照組平均菌落數(shù)）／菌液組平均菌落數(shù)×100%；

稀釋劑對照組的菌回收率（%）＝稀釋劑對照組平均菌落數(shù)／菌液組平均菌落數(shù)×100%。

依法計算回收率，稀釋劑對照組的菌回收率均高于70%，試驗組的菌回收率結(jié)果見表1。

表1 試驗組3次平行試驗的菌回收率（%）

4 控制菌檢查方法驗證

4.1 銅綠假單胞菌 取4瓶膽鹽乳糖培養(yǎng)基（100 mL／瓶），其中2瓶分別加入1：10供試液10 mL，一瓶作為供試品對照組，另一瓶加入銅綠假單胞菌懸液作為試驗組；其余兩瓶一瓶加入銅綠假單胞菌懸液作為陽性對照組，剩余一瓶加入10 mL稀釋液作為陰性對照組；按銅綠假單胞菌檢查法進行檢查，結(jié)果見表2。

表2 銅綠假單胞菌方法驗證結(jié)果

4.2 金黃色葡萄球菌

4.2.1 常規(guī)法 取4瓶營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基（100 mL／瓶），其中2瓶分別加入1∶10供試液10 mL，一瓶作為供試品對照組，另一瓶加入金黃色葡萄球菌懸液作為試驗組；其余兩瓶一瓶加入金黃色葡萄球菌懸液作為陽性對照組，剩余一瓶加入10 mL稀釋液作為陰性對照組；按金黃色葡萄球菌檢查法進行檢查。

4.2.2 薄膜過濾法 取1∶10供試液10 mL，照薄膜過濾法過濾后，用pH 7.0無菌氯化鈉－蛋白胨緩沖液沖洗濾膜5次，每次100 mL，在最后一次沖洗液中加入金黃色葡萄球菌，取出薄膜置于100 mL營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中，作為試驗組；按試驗組方法不加試驗菌懸液制備供試品對照組；按試驗組方法不加供試液制備陽性對照組；取稀釋液1 mL代替供試液，按試驗組操作，不加試驗菌懸液制備陰性對照組，按金黃色葡萄球菌檢查法進行檢查。

表3 金黃色葡萄球菌方法驗證結(jié)果

5 結(jié)果與結(jié)論

由表1可見，采用常規(guī)法和培養(yǎng)基稀釋法時莫匹羅星軟膏對金黃色葡萄球菌和枯草芽孢桿菌的回收率均低于70%，證明這兩種方法下其有明顯抑菌作用；在改用薄膜過濾法后，各試驗菌的回收率均高于70%，表明其抑菌作用已消除。由表2可以看出，采用常規(guī)法時莫匹羅星軟膏對銅綠假單胞菌無抑制作用。由表3可以看出，采用常規(guī)法時，莫匹羅星軟膏抑制了金黃色葡萄球菌的生長；而采用薄膜過濾法時，試驗組和陽性對照組均檢出試驗菌。

根據(jù)以上分析，可以確立莫匹羅星軟膏采用薄膜過濾法進行細菌計數(shù)，采用常規(guī)法進行真菌及酵母菌計數(shù)；控制菌檢查中的銅綠假單胞菌檢查采用常規(guī)法，金黃色葡萄球菌檢查采用薄膜過濾法。

6 討論

6.1 莫匹羅星軟膏為親水性軟膏，輔料為聚乙二醇400和聚乙二醇3350，水中溶解性良好，在供試液制備過程中可直接加45℃恒溫的pH 7.0無菌氯化鈉－蛋白胨緩沖液分散溶解；薄膜過濾時，每張濾膜總沖洗量以500 mL為宜，過少的話不能完全消除其抑菌活性，過多則易損傷濾膜上的微生物。

6.2 試驗用菌株的傳代次數(shù)不得超過5代，并應(yīng)采用適宜的菌種保藏技術(shù)進行保存，以保證其生物學特性。菌液制備后應(yīng)在規(guī)定期限內(nèi)使用，菌數(shù)應(yīng)符合藥典要求。

6.3 做試驗菌的回收率試驗時，加入菌量50～100 CFU為宜。若加菌量過多，采用薄膜過濾法時，菌落擁擠，不好計數(shù)；加菌量過少，則誤差較大。

6.4 測定回收率時，供試液加入菌液后，應(yīng)及時傾注培養(yǎng)基，以避免有抑菌性的供試液對菌液中的活菌造成損害，影響回收率。

［1］國家藥典委員會.中華人民共和國藥典2010年版（二部）［S］.北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2010：附錄107－116.

［2］中國藥品生物制品檢定所，中國藥品檢驗總所.中國藥品檢驗標準操作規(guī)范（2010年版）［M］.北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2010：351－407.

［3］蘇德模，馬續(xù)榮.藥品微生物學檢驗技術(shù)［M］.北京：華齡出版社，2007：221－227.

［4］楊靜.藥品微生物限度檢查法的影響因素分析［J］.中國藥事，2008，22（12）：1095－1096.

［5］杜鵑，范兵，馮慰民，等.三類不同藥品的微生物限度檢驗方法驗證比較［J］.藥物分析雜志，2006，26（6）：840－842.

［6］國明，祝清芬，鄭力真.無菌、微生物限度及細菌內(nèi)毒素檢查方法學驗證中常見問題及分析［J］.中國藥品標準，2008，9（1）：46－49.

［7］陳健梅.微生物檢查方法驗證及其影響因素分析［J］.中國醫(yī)藥導(dǎo)報，2008，5（12）：66－68.

Verification ofmethodology for them icrobial lim it test of M upirocin Ointment

YANG Yu-lin，JIYing-jie
（Luoyang Institute for Food and Drug Control，Luoyang 471023，China）

ObjectiveTo establish a microbial limit testmethod for Mupirocin Ointment.M ethodsAccording to Chinese Pharmacopoeia，common method，dilution method and membrane filtration method were used for the verification of methodology on Mupirocin Ointment.ResultsThe results suggested thatmembrane filtrationmethod can be used for count of bacteria and detection of staphylococcus aureus.Commonmethod can be used for count ofmolds and yeasts，detection of pseudomonas aeruginosa.ConclusionThemicrobial limit testof Mupirocin Ointmentwas established，and themethod was assured.

Mupirocin ointment；Microbial limit test；Verification ofmethodology

R927.11

A

2095－5375（2014）10－0592－003

楊育林，男，主管藥師，研究方向：藥品檢驗，E－mail：yyl009＠126.com