施萬細胞培養與純化研究進展

李 陳(綜述)，肖玉周(審校)

(蚌埠醫學院第一附屬醫院骨科，安徽 蚌埠 233000)

施萬細胞是周圍神經所特有的一種膠質細胞，主要功能是對軸突提供支持與保護、形成髓鞘，并且能分泌多種活性物質(如神經營養因子、細胞外基質及黏附因子等)，這些活性物質對維持神經纖維的存活、生長以及損傷后的再生具有重要的生物學作用[1]。目前，以移植施萬細胞治療神經損傷及誘導神經鞘再生的組織工程學成為研究的熱點[2]。在周圍神經的軸突損傷后，施萬細胞從損傷神經遠側端清除軸突和髓鞘崩解物，同時施萬細胞可分泌促神經再生的各類因子，為軸突營造適宜的再生環境[3]。因此，施萬細胞是組織工程中種子細胞的最佳選擇。但在組織工程實施過程中，高純度的施萬細胞需求往往很大，因此其體外培養、純化、擴增顯得至關重要。

1 施萬細胞的來源與取材

1.1細胞來源 施萬細胞的傳統來源主要是從鼠、兔、猴等哺乳動物的胚胎或新生動物取材，但動物來源的施萬細胞作為種子細胞在臨床應用時卻受到相對的受限，近年來研究的重點放在人來源的施萬細胞上，能夠更有效的減少免疫排異反應。研究發現，直接從新鮮的周圍神經取材進行施萬細胞的培養產量較低，很難達到實際的需求[4-5]。大多數的研究人員采用預變性的周圍神經作為取材對象，施萬細胞在成年動物周圍神經被切斷后的Waller變性的早期大量增殖，許多學者通過對成年動物周圍神經進行預變性來獲得更多數量的施萬細胞，因為神經損傷后巨噬細胞能夠分泌生長因子，能促進施萬細胞分裂[6]。

1.2取材 施萬細胞的主要取材部位有：正中神經、坐骨神經等混合神經以及背根神經節等，且實驗表明運動與感覺神經來源的施萬細胞分泌的神經營養因子不同，至于何種來源的施萬細胞治療效果明顯，還有待探索[7]。取材過程中關鍵在于去除參雜的成纖維細胞，由于其主要存在于神經外膜和神經束膜中，應盡可能去除這些成分。

2 施萬細胞培養方法

2.1植塊法 植塊法原理是成纖維細胞的增殖速度要比施萬細胞快，通過反復的貼壁便可以獲得較高純度的施萬細胞。此方法培養的周期較長，且培養過程中伴隨著細胞活性及分裂能力的下降。有人在此基礎上做出了改進，采用直接植塊法和反復植塊法，即將施萬細胞種植于鼠尾膠包埋的共聚物支架上，減少了反復消化離心和差速貼壁造成的對細胞生長周期的影響，從而使培養的施萬細胞保持穩定的生物學功能[8]。在此基礎上反復多次，就是反復植塊法。

2.2酶消化法 酶消化法的主要原理是用酶去除組織中的間質，使組織更為分散而使細胞呈單層排列。Qin等[9]將植塊反復種植法和酶消化法聯合使用，用0.25%Ⅴ型膠原酶和0.03%胰蛋白酶消化出生3 d 的SD大鼠鼠臂層神經和坐骨神經組織塊40 min，再將組織塊貼壁培養。采用組織塊反復種植純化法、低濃度胰酶快速消化和差速貼壁法對施萬細胞進行純化，結果施萬細胞活性較高，純度可達90%以上，細胞所受到的外界因素影響也較少。

2.3三維培養法 植塊法、酶消化法主要是基于二維培養方法，然而體外細胞培養的一個重要原則是需模擬體內細胞生長環境，該模擬系統中最重要的核心因素是細胞與培養環境之間的相互作用。不同于傳統的二維化單層細胞培養，三維細胞培養技術是將具有三維結構不同材料的載體與各種不同種類的細胞在體外共同培養，使細胞能夠在載體的三維立體空間結構中遷移、生長，構成三維的細胞載體復合物。三維細胞培養是將細胞培植在一定的細胞外基質中，細胞外基質蛋白充當生長支架，使得細胞能夠分化產生一定的三維組織特異性結構，所創建的細胞生長環境則最大程度地模擬體內環境[10]。在施萬細胞的培養中也有學者采用該方法進行培養，在培養液中放入三維支架，使細胞貼壁，形成Bungner帶，支架的主要材料是膠原，其次還有聚酯纖維、聚乳酸等[11]。Moradi等[12]采用三維自組裝多肽水凝膠作為基質三維培養人胎兒施萬細胞，結果培養出的施萬細胞活性較高，細胞形態更加典型，且0.25%水凝膠效果最佳，能夠形成良好的形成納米纖維支架結構。

3 施萬細胞純化方法

植塊法和酶消化法是施萬細胞培養的最經典的兩種方法，雖然其操作簡便，但是所獲得的細胞中容易混有雜質細胞(主要是成纖維細胞)。為此，人們在這兩種方法的基礎上不斷改進，有了一系列除去成纖維細胞的提純方法。

3.1抗有絲分裂法 抗有絲分裂劑有阿糖胞苷等，能夠對S期細胞產生特異性殺傷，并且能抑制DNA多聚酶，干擾DNA的合成與復制。Wei等[13]采用阿糖胞苷處理細胞24 h，然后將培養基更換為含0.02 μg/L外源性生長因子處理48 h，最后采用差速貼壁法，經過10 d的原代培養，進行傳代，最終第5代施萬細胞的純度可達到99%。也有報道顯示，這些抗有絲分裂劑缺乏特異性，會對施萬細胞產生一定的毒性，會阻斷神經生長因子轉導，影響神經的再生，因此不適合在臨床上推廣[14]。

3.2免疫選擇純化法 胸腺嘧啶1(thymine-1，Thy-1)抗原特異性表達于成纖維細胞，通過反復使用Thy-1抗體，結合補體介導的細胞裂解利用，能夠培養出高純度的施萬細胞[4-5]。Nash等[15]通過向培養液中加入抗Thy-1抗原，37 ℃孵育30 min，然后轉到含免疫球蛋白G的培養基上，成纖維細胞黏附到培養基上，最后將施萬細胞重新吸出，原代培養10 d，純度可達90%，第5代純度高達99%；細胞密度為2×107L-1。然而，該方法存在著培養效率低、費時費力、價格昂貴等劣勢，很難在臨床上推廣。

3.3免疫磁珠法 免疫磁珠是一項新的免疫學技術，它運用核-殼的合成方法合成含有四氧化三鐵超順磁性的高分子表面覆蓋高分子，其穩定性好，能進行后期標記，利用這些物質表面的功能基團(如氨基、羧基、巰基等)進行抗體的共價或者非共價偶聯，可用于結合施萬細胞表面特有的標記抗原p75抗原，這樣在外加磁場的吸引下可作定向移動，從而達到分離提純施萬細胞的目的。Vroemen等[16]應用該方法，經過9 d的原代培養后分離出了純度為95%的施萬細胞，細胞密度為1×107L-1。黃明等[17]在免疫磁珠法基礎上加以改進，采用雙酶2次法培養施萬細胞，7 d后應用免疫磁珠法對細胞進行純化培養，純化后施萬細胞純度為98.0%，培養2 d后就可以傳代。使用具有抗Thy-1標記的磁珠，除去成纖維細胞已有報道[18]。然而，這種方法也面臨著費時、價格昂貴等的特點。

3.4神經刺激因子純化法 在正常施萬細胞培養的過程中加入刺激因子，如牛垂體抽提物(bovine pituitary extract，BPE)，BPE含有多種生長因子(如內源性堿性成纖維細胞生長因子1神經生長因子等)，這些生長因子也具有激活腺苷環化酶的活性，它們可以通透細胞，激活腺苷酸環化酶，從而升高細胞內的環腺苷酸水平，能夠促進施萬細胞的有絲分裂，促進施萬細胞增殖的作用。趙勇等[19]將成年兔發生Wallerian變性的雙側坐骨神經剪碎至1 mm3的植塊，反復差速貼附法進行培養，同時用內源性堿性成纖維細胞生長因子、forskolin刺激增殖，結果可獲得施萬細胞的純度達94%以上。由于這些刺激因子的特異性不強，在促進施萬細胞有絲分裂的同時也會促進成纖維細胞的生長。

3.5條件培養基純化法D-氨基酸氧化酶基因在施萬細胞的水平顯著高于成纖維細胞，其能夠分解利用D-纈氨酸[20]。因此，利用此原理能夠達到純化施萬細胞的目的。Kaewkhaw等[21]采用預變性7D的大鼠坐骨神經，然后去除外膜，游離組織酶，然后在改良杜氏伊格爾培養液(dulbecco′s modified eagle medium，DMEM)-D-纈氨酸中培養，DMEM培養液中加入促有絲分裂因子，包括Forskolin、胎牛血清和BPE，結果：原代施萬細胞純度為97.3%，第2代純度達98.3%，經過培養19 d后細胞密度為1.2×108L-1。該方法特點為產量高、純度高、細胞活性高、培養操作簡便等，但培養周期較長。

3.6層粘連蛋白純化法 由于施萬細胞在生長過程中會黏附在基膜上，而層粘連蛋白是基膜的主要成分，施萬細胞對于層粘連蛋白有著很強的親和力，因此將層粘連蛋白包被在培養基的底物上，然后將分離的施萬細胞添加到培養基中，施萬細胞將會先于成纖維細胞結合到培養基中，這樣經歷幾個循環，就可以獲得純度較高的施萬細胞。Pannunzio等[22]應用該方法，經過5代培養，得到的施萬細胞純度可達90%左右。該方法純化細胞的周期較短，但純度相對較低。

3.7非特異性的純化方法 非特異性的純化方法很常見，如冷噴射法，該方法是利用在較冷環境中不同細胞貼壁能力的不同，采用預冷的磷酸緩沖液沖擊貼壁細胞，使某種細胞先脫落，而達到純化細胞的目的。研究表明，施萬細胞較成纖維細胞黏附性弱，將首先被沖下來，將其搜集起來繼續培養，從而達到純化施萬細胞的目的[23]。該方法由Jirsová等[24]首先報道，選取15 d齡大鼠，分離背根神經節，采用酶消化法處理組織，待細胞長滿后以冷噴射法提純施萬細胞，一次純化細胞純度可達到95%，并可在之后的純化中使施萬細胞純度達到99%以上。Mauritz等[25]也采用該方法并采用預變性的大鼠坐骨神經，培養基中加入BPE、forskolin、成纖維生長因子2，采用冷噴射法去除成纖維細胞，經過21 d的原代培養，融合度達到80%傳代，第2代純度達69%，第3代達94%，且細胞密度較高，達1.2×108L-1。該方法有操作方便，不必使用細胞毒性化學試劑，且純化效果好等優點。冷噴射法的不足：最主要的是該方法對溫度要求較高，高的環境溫度會使4 ℃的冷噴射液快速升溫，使施萬細胞難以被噴射液吹落；而加大噴射力度勢必造成成纖維細胞的脫落，難以達到純化的目的。李爽等[26]在經典冷噴射法的基礎上對其進行改良，對施萬細胞采用冰浴處理，使培養液快速降低到接近冰水混合物的溫度，克服了溫度對實驗效果造成的影響。

4 小 結

近年來隨著醫學的長足發展，用組織工程學的方法來修復損傷神經成為一種趨勢，施萬細胞作為周圍神經所特有的膠質細胞，其在周圍神經發育與再生過程中的特殊作用，使其成為組織工程中重要的種子細胞，越發引起學者們的重視。高純度、高活性的施萬細胞成為組織工程技術在臨床成功應用的保證，現如今人們對其培養與純化技術已經有了一定程度的探索，但是目前還存在著如純度低、周期長、活性弱等方面的不足，希望在不遠的將來能夠攻破這些難關，更好地造福于人類。

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