組成型光形態建成蛋白1介導p53及Jun激酶泛素化通路的研究進展

楊文博(綜述)，烏蘭齊齊格,達林泰(審校)

(內蒙古醫科大學附屬醫院口腔科，呼和浩特 010050)

組成型光形態建成蛋白1(constitutively photomorphogenic protein 1，COP1)，也稱為RFWD2[1]，是一個光形態建成的抑制子。首先發現于擬南芥，其主要作用為抑制光介導的植物生長。在黑暗環境下COP1位于細胞核內，光照環境下位于細胞質中，可降解胚軸蛋白5(hypocotyl 5，HY5)、長波遠紅光蛋白1(long after far-red light1，LAF1)和長胚軸遠紅光蛋白1(long hypocotyl in far-red1，HFR1)[2]。在哺乳動物中，COP1可作為p53泛素化的一種E3連接酶，能夠抑制p53轉錄激活活性、促進依賴p53的細胞凋亡。COP1的過表達可促進細胞增殖、細胞分化以及腫瘤發展。COP1在肝癌、胃癌、肺癌、食管癌、乳腺癌、卵巢腺癌中具有高表達，相關報道表明COP1的表達與腫瘤的浸潤程度呈正相關，COP1作為一種腫瘤抑制蛋白與p53呈負調節，影響p53依賴的轉錄、細胞凋亡、細胞周期阻滯和DNA修復[3]。目前研究表明，p53泛素化經典途徑是鼠雙微粒體蛋白2(murine double-minute 2，MDM2)及p53介導的環狀H2蛋白(p53-induced ring-h2 protein，Pirh2)，COP1途徑是p53泛素化的非MDM2依賴途徑[4]。本文將對COP1的基本結構及對p53、Jun激酶的表達調控和影響因素研究進展進行綜述，為COP1/p53泛素化及Jun激酶信號通路全面解析奠定基礎。

1 COP1的結構

COP1最先見于植物光調控發育報道。近年來COP1在哺乳動物中的表達及功能也被廣泛關注，COP1已被認為是腫瘤抑制因子p53的一個重要的負調節因子，COP1是一個由675個氨基酸組成的相對分子質量為76×103的可溶性核蛋白，在二級結構上，它由3個特殊的結構域組成，即N端的環形鋅指結合域(ring finger zinc binding domain，RING)、中間的卷曲螺旋形結構域、C端的WD-40重復序列(WD-40)。此外，還含有一個核定位信號和一個新型細胞質定位信號。

COP1的環形鋅指結構域易于Zn離子結合，是一個整合的結構單元，其保守序列為CX2CX(9-39)CX(1-3)CX(2-3)CX2CX(4-48)CX2C3HC4。環形鋅指結構域形成的是一個整合的結構單元而不是兩個串聯的鋅指模型。其作用是介導蛋白質與蛋白質間的相互作用[5]；卷曲螺旋結構域含有82個氨基酸，其二級結構為連續的α螺旋，呈高度負電荷化。該結構域的功能是負責與DNA結合，同樣也具有蛋白質與蛋白質間的相互作用，該結構域與WD-40重復序列之間的區域若缺失則會嚴重抑制COP1的失活，若在該結構域內插入氨基酸片段后COP1活性明顯降低，可見卷曲螺旋結構與WD-40重復序列之間的該區域為COP1的關鍵區域；WD-40重復序列含有四個完整的WD-40重復序列及兩個不完整的重復序列，同時具有與DNA結合作用及蛋白質與蛋白質結合作用。若WD-40重復序列結構改變，氨基酸缺失則導致功能相反，即COP1b，可見WD-40重復序列區域是COP1行使其功能的重要區域；COP1中細胞質定位信號和核定位信號分別位于COP1氨基酸殘基上及C端，細胞質定位信號與環形鋅指類結構及卷曲螺旋結構部分重疊可引導COP1核分布。

2 COP1的功能

COP1參與植物生長發育，哺乳動物細胞的存活、生長和代謝。在植物中是一種重要的光敏色素相互作用蛋白，植物中轉錄因子COP1主要作用于LAF1、HY5、HYH和HFR1及光感受器，其中包括光敏色素A和隱花素1.5的泛素依賴性蛋白酶體降解[6]。在黑暗狀況下COP1位于細胞核內，作為一種抑制E3泛素連接酶為目標的蛋白質[7]，如光形態建成，促進轉錄因子HY5破壞的形態建成[8]，針對位于核內的轉錄因子蛋白酶體介導的降解。轉移至光下后，COP1變為非激活狀態，遷移到細胞質，使光形態進行，但剩余細胞質下調光信號介導的光敏色素A[9]。在這里，若等位基因COP1憑借轉移出細胞核和通過抑制的蛋白質-蛋白質相互作用，從而使光形態繼續進行。即降低而不是在紅光下的黑暗提高子葉展開的能力。相反，COP1過表達可去除黃化不良在藍色或遠紅外紅光下照射增強型光形態建成。

COP1雖然在哺乳動物細胞中不發生光形態建成，但哺乳動物細胞中的COP1與擬南芥COP1有同源性的。近期研究表明，突變的COP1及其蛋白底物在多種人類惡性腫瘤中有表達，如肝癌、胃癌、肺癌、食管癌、乳腺癌、卵巢腺癌中具有高表達，COP1的過表達可促進細胞增殖、細胞分化以及腫瘤發展。哺乳動物中的COP1與擬南芥中COP1蛋白結構相似，同樣包括N端RING，一個內部的卷曲螺旋結構域和C端WD40重復。但是，哺乳動物COP1與植物COP1相比具有N端延伸，可能是負責針對COP1核膜。此外，哺乳動物的COP1擁有E3泛素連接酶的活性。COP1除了具有內在E3活性，其還在擬南芥和哺乳動物細胞中參與多種蛋白底物泛素化，促進其蛋白酶體降解，COP1參與形成E3泛素連接酶復合物，其中包含在人類細胞中存在的一些E3復合物，如de-etiolated 1(DET1),DNA damage-binding protein 1(DDB1),culline 4(CUL4)[10]及ring-box 1(RBX1)。COP1的底物的被逐漸識別，包括ACC1(acetyl-coenzyme A carboxylase alpha),MTA1(metastasis-associated protein 1),FOXO1(forkhead box protein O1)，TORC2(transducer of regulated CREB activity 2)和PEA3(polyomavirus enhancer activator-3)[11]。COP1蛋白是能夠針對轉錄因子HY5(擬南芥)和Jun激酶(在人類)的泛素化和蛋白酶體介導的降解。在哺乳動物細胞中,COP1是一個進化上保守的環狀鋅指結構域內Cullin的環連接酶(CRL)復合物，可促進Jun激酶的和p53泛素化的泛素連接酶的作用。作為p53負調節因子，研究COP1蛋白表達與p53蛋白在人類癌癥狀態之間的關系是至關重要的。COP1與Jun家族的亮氨酸結合。作為一種功能性相互作用的結果，在哺乳動物細胞中表達COP1能有效下調Jun激酶轉錄所依賴的目標基因激活蛋白1(apetala1,AP-1)的表達。COP1的RING可表現出體外泛素連接酶的活性，但由COP1抑制依賴AP-1轉錄的Jun激酶蛋白水平表達的變化表明，Jun激酶降解是獨立于這種抑制作用。擬南芥中COP1在控制基因表達的重要屬性提示，COP1在哺乳動物細胞可能成為一個新的腫瘤調節因子。

2.1COP1與p53泛素化途徑 p53作為應激激活的序列特異性轉錄因子，激活轉錄開始于含有p53的結合位點共識的激活子。此外，p53蛋白因其具有有效的轉錄抑制功能，在基因水平具有調控作用。因此，它可以保護細胞免受各種應激信號，如DNA損傷、核苷酸耗竭和原癌基因激活，參與細胞周期阻滯、凋亡基因激活轉錄、DNA修復，并且抑制基因參與血管生成、抗細胞凋亡、細胞周期進程。激活p53后，可能會導致生長停滯、衰老或凋亡，從而防止細胞受損基因組復制。p53在無應力細胞中迅速轉化由蛋白酶體依賴性途徑，這是通過E3泛素連接酶COP1蛋白與PIRH2和MDM2底物識別來完成的[12]。MDM2是p53的主要負調控因子，是由Momand等首先提出的[13]，其主要功能為介導p53蛋白降解和抑制p53轉錄活性；調節p53的核-漿交換[14]。MDM2蛋白的基因已被證明是上調的基因擴增和過表達的腫瘤。MDM2蛋白已被證明對腫瘤細胞的增殖和過表達有影響。野生型p53基因在各種癌癥中，MDM2蛋白的過表達和(或)擴增的頻率是比較低的，盡管MDM2蛋白仍隱藏致癌特性。Pirh2途徑是由Duan等首次研究報道，磷酸化修飾會導致Pirh2蛋白自身不穩定以及改變Pirh2蛋白的亞細胞定位，使Pirh2蛋白處于細胞核外，也有研究發現，Pirh2不依賴于MDM2促進p53降解，Pirh2通過負反饋環路調控p53的功能，導致介導p53泛素化降解功能的喪失；而COP1可作為p53泛素化的一種E3泛素連接酶，能夠抑制p53的逆轉錄活性和依賴p53細胞凋亡，COP1可以使p53直接泛素化而不依賴MDM2及Pirh2途徑[15]。現行對p53研究表明在哺乳動物細胞DNA受損時，p53表達水平升高，p53乙酰化及磷酸化，此時p53可通過MDM2和Pirh2途徑及COP1途徑泛素化，從而抑制其逆轉錄活性，阻止受損細胞周期的繼續[16]。

2.2COP1與Jun激酶蛋白 Jun激酶作為Jun家族(還包括V-Jun、JunB及JunD等)的轉錄因子之一，Jun激酶基因的閱讀框架有340個氨基酸,其蛋白產物c-Jun氨基端激酶(c-Jun N-terminal kinase，JNK)的相對分子質量為37×103～39×103的蛋白，JNK可以形成同源二聚體,但更多的是形成AP-1。Jun亞類成員可與任何AP-1家族轉錄因子通過亮氨酸拉鏈結合形成同源或異源二聚體,或與另一類含堿性亮氨酸拉鏈的轉錄激活因子(transcription activator,ATF)形成Jun-ATF2異源二聚體;參與細胞周期中細胞的生長及凋亡[17]。由于Jun激酶增殖作用，異常的激活Jun激酶在多種腫瘤細胞中也有過表達，與p53類似Jun激酶也是一種極不穩定的蛋白，受多個泛素連接酶限制。從相關研究報告中可得知，COP1、FBW7(F-box/WD重復蛋白7)[18]和相互作用蛋白4(ITCH)均可促進Jun激酶的泛素化。Jun激酶以非磷酸化和磷酸化形式存在。JNK位于胞質,通過蘇氨酸和酪氨酸殘基羥基側鏈的雙重磷酸化而被激活。JNK蛋白激酶有3個基因編碼:JNK1、JNK2和JNK3。JNK1和JNK2基因在全身廣泛表達,而JNK3呈限制性表達,僅見于腦、心臟和睪丸[19]。正是由于3種基因的不同分布,特別是JNK3,使他們執行不同的細胞功能。JNK1和JNK2主要在生物學和病理過程中發揮作用,尤其是免疫系統；JNK3主要表現在神經系統,尤其是神經細胞死亡[20]。JNK可激活Jun激酶，使其磷酸化。在人類癌細胞中，隨著p53表達的減少或缺失，導致JNK活化和Jun激酶轉錄活性增加。JNK信號途徑可以調控細胞生長、癌基因轉化、細胞分化和細胞凋亡等多種生命過程，JNK信號通路的活化與誘導癌細胞的凋亡有關，因而有抗癌效應[21]。近年來的研究表明，JNK還與多種疾病發生機制有關(阿爾茨海默病、帕金森病、角膜炎、糖尿病)[22]，從而使JNK在臨床上可作為一個潛在的分子治療靶點。進一步研究發現，Jun激酶作為COP1的一個重要的生理指標，COP1保持Jun激酶在體內較低水平，從而調制Jun激酶/AP-1轉錄活性。更重要的是，COP1使Jun激酶的依賴性細胞增殖缺乏刺激[23]。研究表明在多種癌癥中COP1缺失是導致Jun激酶在人類癌癥的上調機制之一。因此，認為COP1具有腫瘤抑制功能。

3 展 望

目前研究表明，COP1的研究已從植物發展到哺乳動物，在人類多種腫瘤細胞中，COP1均有高表達，COP1作為一種E3泛素連接酶，分布于細胞核及細胞質內的COP1對p53及Jun激酶抑癌基因的泛素化有負調節作用，COP1對促進了腫瘤的發生及發展，已得到初步證明。通過研究COP1對p53及Jun激酶的作用機制，進一步了解COP1對腫瘤的發生機制影響，為未來抑制腫瘤發生及生長奠定一定的理論基礎，COP1是否可以作為研究臨床腫瘤分子治療的潛在目標靶，需進一步探索。

[1] Schwechheimer C,Deng XW.The COP/DET/FUS proteins-regulators of eukaryotic growth and development[J].Semin Cell Dev Biol，2000，11(6):495-503.

[2] Osterlund MT,Hardtke CS,Wei N,etal.argeted destabilization of HY5 during light-regulated deveopment of Arabidopsis[J].Nature，2000，405(6785):462-466.

[3] Wei W,Kaelin WG Jr.Good COP1 or bad COP1? In vivo veritas[J].J Clin Invest,2011,121(4):1263-1265.

[4] 冉麗，文格波，曹仁賢.p53泛素化的非Mdm2依賴途徑[J].國際病理科學與臨床雜志,2007,27(5):414-417.

[5] Bianchi E,Denti S,Catena R,etal.Characterization of human constitutive photomorphogenesis protein 1,a RING finger ubiquitin ligase that interacts with Jun transcription factors and modulates their transcriptional activity[J].Biol Chem,2003,278(22):19682-19690.

[6] Li YF,Wang DD,Zhao BW,etal.high level of cop1 expression is associated with poor prognosis in primary gastric cancer[J].J Biol Sci,2012,8(8):1168-1177.

[7] Shi D,Gu W.Dual roles of mdm2 in the regulation of p53:ubiquitination dependent and ubiquitination independent mechanisms of mdm2 repression of p53 activity genes cancer[J].Genes Cancer,2012,3(3/4):240-248.

[8] Huang X,Ouyang X,Yang P,etal.Arabidopsis FHY3 and HY5 Positively Mediate Induction of COP1 Transcription in Response to Photomorphogenic UV-B Light[J].Plant Cell,2012，24(11):4590-4606.

[9] Ganpudi AL,Schroeder DF.Genetic Interactions of Arabidopsis thaliana Damaged DNA Binding Protein 1B(DDB1B) With DDB1A,DET1,and COP1[J].G3(Bethesda),2013,3(3):493-503.

[10] Kobayashi S,Yoneda-Kato N,Itahara N,etal.The COP1 E3-ligase interacts with FIP200,a key regulator of mammalian autophagy[J].BMC Biochem，2013，14:1.

[11] Yi C,Deng XW.COP1-from plant photomorphogenesis to mammalian tumorigenesis[J].Trends Cell Biol,2005,15(11):618-625.

[12] Satija YK,Bhardwaj A,Das S.A portrayal of E3 ubiquitin ligases and deubiquitylases in cancer[J].Int J Cancer,2013，133(12):2759-2768.

[13] Dornan D,Shimizu H,Mah A,etal.ATM engages autodegradation of the E3 ubiquitin ligase COP1 after DNA damage[J].Science,2006,313(5790):1122-1126.

[14] Hai T,Wolfgang CD,Marsee DK,etal.ATF3 and stress responses[J].Gene Expr,1999,7(4/6):321-335.

[15] Oliner JD,Kinzler KW,Meltzer PS,etal.Amplification of a gene encoding a p53-associated protein in human sarcomas[J].Nature，1992，358(6381):80-83.

[16] Wang L,He G,Zhang P,etal.State Key Laboratory of Genetic Engineering,Interplay between MDM2,MDMX,Pirh2 and COP1:the negative regulators of p53[J].Mol Biol Rep，2011，38(1):229-236.

[17] Mariani O,Brennetot C,Coindre JM,etal.JUN oncogene amplification and overexpression block adipocytic differentiation in highly aggressive sarcomas[J].Cancer Cell,2007，11(4):361-374.

[18] Kato S,Ding J,Pisck E，etal.COP1 functions as a FoxO1 ubiquitin E3 ligase to regulate FoxO1-mediated gene expression[J].J Biol Chem，2008，283(51):35464-35473.

[19] Brnjic S,Olofsson MH,Havelka AM,etal.Chemical biology suggests a role for calcium signaling in mediating sustained JNK activation during apoptosis[J].Mol Biosyst,2010,6(5):767-774.

[20] Kuan CY,Yang DD,Samanta Roy DR,etal.The JNK1 and JNK2 protein kinases are required for regional specific apoptosis duringearly brain developmnt[J].Neuron,1999,22(4):667-676.

[21] 郭連英，楊瀧，施廣霞，等.JNK/SAPKs信號轉導通路在欖香烯抗肝癌效應中的作用[J].中國腫瘤生物治療雜志，2005，12(3):202-205.

[22] Weston CR,Davis RJ.The JNK signal transduction pathway[J].Curr Opin Cell Biol，2007，19(2):142-149.

[23] Migliorini D,Bogaerts S,Defever D,etal.Cop1 constitutively regulates c-Jun protein stability and functions as a tumor suppressor in mice[J].J Clin Invest，2011，121(4):1329-1343.