Bcl-2家族促凋亡蛋白Bim在骨改建中的作用及調節

宋祥晨(綜述)，梁 敏(審校)

(中山大學光華口腔醫學院附屬口腔醫院牙周病科 廣東省口腔醫學重點實驗室，廣州 510055)

人的一生中骨組織不斷地進行著改建，骨改建是由骨吸收與骨形成精密控制的生理過程，其中破骨細胞、成骨細胞分別是骨吸收、骨形成的功能細胞[1]。細胞凋亡在胚胎肢體骨發育、骨改建中發揮重要作用，其中骨細胞即終末分化的成骨細胞凋亡增多被認為是骨改建活躍的標志；行使骨吸收功能后，破骨細胞迅速發生凋亡，骨吸收造成的骨陷窩由成骨細胞占據并形成新骨，隨后部分成骨細胞被骨基質包埋轉變為骨襯細胞，其余發生凋亡。由此可見，成骨細胞、破骨細胞凋亡對骨改建起著重要作用[2]。Bcl-2 interacting mediator of cell death(Bim)是Bcl-2家族促凋亡蛋白成員，介導內在凋亡通路的發生，并廣泛參與健康細胞及腫瘤細胞凋亡[3-5]。該文就Bim在骨改建中的作用進行綜述。

1 細胞凋亡

細胞凋亡是程序性細胞死亡，是受基因調控的細胞自滅過程，在維持機體正常發育，穩定內環境，清除腫瘤細胞、自身反應性淋巴細胞和微生物感染細胞中具有重要意義。細胞凋亡主要由死亡受體信號通路、線粒體信號通路介導[6]。線粒體信號通路又稱內在通路，由Bcl-2家族成員介導[7]。根據結構與功能的差異，Bcl-2家族成員可分為三種亞型：①含有多個BH域的抗凋亡蛋白，包括Bcl-2、Bcl-xL等；②含有多個BH域的促凋亡蛋白，包括Bak和Bax；③唯BH3域蛋白，包括Bim、Bid、Bad、BNIP3等[8]。唯BH3域蛋白在組織發育、維持內環境穩定及防治腫瘤中發揮作用。在外界刺激作用下，唯BH3域蛋白表達增高或活性增強后激活Bak/Bax。活化的Bak/Bax形成六聚體聚集在線粒體外膜形成孔道，導致細胞色素C的釋放，與凋亡酶激活因子Apaf-1、ATP結合形成的多聚體募集并活化胱天蛋白酶(caspase)-9，最終激活下游執行者caspase-3、caspase-7，導致細胞凋亡[8-9]。

2 Bim的結構與生物學功能

2.1Bim的發現及結構 Bim是唯BH3域蛋白家族中的一員。O′Connor等[10]于1998年使用32P標簽的Bcl-2蛋白是從T細胞淋巴瘤KO52DA20建立的λ噬菌體cDNA中篩選獲得；同年Hsu等[11]，使用酵母二元雜交從卵巢cDNA中篩選出與髓細胞白血病基因1(Mcl-1)結合的Bcl-2-related ovarian death agonist(BOD)，證實是Bim的直系同源蛋白質。

由于mRNA選擇性剪接的差異，Bim mRNA存在三種亞型：BimEL、BimL、BimS。O′Connor等[10]發現 3種翻譯后產物BimEL、BimL、BimS均可通過BH3結構域與Bcl-2蛋白結合，其中BimS拮抗Bcl-2的抗凋亡作用最強。Adachi等[12]根據結構的差異，將后續發現的18種Bim亞型分為6組：BimEL、BimL、BimS、BimD、BimDd和BimEDd。其中小鼠BimEL含196個氨基酸，除含有BH3結構域外，還包含2個泛素化位點、3個核糖體蛋白S6激酶磷酸化位點、1個β-transducinrepeats-containingproteins(β-TrCP)結合模板、3個胞外信號調節激酶(extracellular signal-regulated kinase，ERK)磷酸化位點和1個c-Jun氨基端激酶磷酸化位點[13]。

2.2Bim的生物學功能 正常情況下，BimEL/L結合于微管動力蛋白輕鏈1/動力蛋白輕鏈亞基(LC8)，形成微管動力蛋白復合體。在凋亡信號刺激下，c-Jun氨基端激酶活化，并磷酸化Bim位于動力蛋白結合域的Ser56，致Bim與LC8同時從動力蛋白復合體上釋放，并參與凋亡活動[14]。

Bim可通過直接結合和間接替代兩種模式激活Bak/Bax。①直接結合模式：Bim直接與Bak/Bax結合致其發生構象改變而活化；②間接替代模式：Bim與所有Bcl-2抗凋亡蛋白家族成員均具較高的親和力，故Bim可將Bak/Bax從Mcl-1/Bcl-xL中替代出來而活化[15]。除此之外，Weber等[16]發現BimS還可直接插入線粒體外膜，致細胞發生凋亡，而不依賴與Bcl-2/Mcl-1或Bak/Bax的結合。

2.3Bim在骨改建中的作用及調節機制 骨改建過程包括破骨細胞激活期、吸收期、逆轉期、成骨細胞成骨期，由基礎多細胞單位完成[17]。基礎多細胞單位含有3種細胞成分：破骨細胞、成骨細胞、骨細胞。細胞凋亡影響成骨細胞與破骨細胞的數量及功能，從而調節骨代謝平衡，而Bim作為細胞凋亡的重要調節因子，在骨改建中發揮關鍵作用。

2.3.1Bim在破骨細胞中的作用及調節機制 骨改建往往由破骨細胞行使骨吸收開始，Bim在破骨細胞凋亡中的作用及調節研究較多。Akiyama等[18]發現，破骨細胞在營養因子(巨噬細胞集落刺激因子)缺乏時迅速凋亡并伴隨Bim表達上調；而敲除bim基因的破骨細胞，體內外存活率均升高。Houde等[19]和Sugatani等[20]通過siRNA干擾破骨細胞bim基因表達后均發現破骨細胞凋亡減少及存活率增加。Bim在破骨細胞凋亡中的作用機制研究表明，巨噬細胞集落刺激因子、核因子κB受體活化因子配體缺乏時，轉化生長因子β可上調Smad2及p38 Bim表達而誘導破骨細胞凋亡[19]。Matsumoto等[21]證實，含氮二磷酸利塞膦酸鹽經內在凋亡通路上調Bim表達來誘導破骨細胞凋亡，而對敲除bim基因(bim-/-)小鼠及轉染促分裂原活化的蛋白激酶激酶1的破骨細胞無凋亡作用。以上研究提示，Bim在破骨細胞凋亡中發揮重要作用。

Bim除在破骨細胞凋亡中發揮作用外，對破骨細胞骨吸收能力也有影響。Akiyama等[18]發現與野生型(bim+/+)相比，bim-/-的小鼠破骨細胞，其骨吸收能力降低，同時bim-/-小鼠可出現輕微的骨質硬化；而bim-/-的破骨細胞轉染bimL后細胞存活率降低，同時伴有骨吸收能力恢復。Bcl-2家族抗凋亡成員Bcl-xL的相關研究[23]表明，過表達Bcl-xL/SV40 T抗原基因的小鼠破骨細胞，其宿主小鼠同樣出現骨質硬化現象；Iwasawa等[24]進一步發現，Bcl-xL可通過降低細胞外基質的分泌而減弱破骨細胞的骨吸收能力，因此推測促凋亡蛋白Bim與Bcl-2家族抗凋亡蛋白之間的平衡對骨代謝至關重要。

大量研究發現，在腫瘤細胞、神經細胞、心肌細胞凋亡中Bim存在基因水平、蛋白合成水平及蛋白合成后水平等多層次調節，而Bim在破骨細胞凋亡中的調節主要是蛋白合成后水平的調節[4,25-29]。Akiyama等[18]、Wakeyama等[30]和Bradley等[31]相繼證實破骨細胞凋亡中bim mRNA表達并未發生改變，但Akiyama等[18]發現Bim在破骨細胞中受c-Cbl介導的泛素化蛋白酶體降解調控。Bradley等[31]研究同樣證實轉錄因子EGR-2可通過上調c-Cbl表達降解Bim。Purev等[32]進一步證實，敲除破骨細胞c-Cbl、Cbl-b基因可顯著上調Bim表達并誘導破骨細胞凋亡，同時破壞細胞偽足小體及微管系統，推斷Cbl家族可通過調節細胞支架影響Bim的泛素化降解。針對破骨細胞凋亡中Bim的調節機制，Sugatani等[20]、Wakeyama等[30]先后發現破骨細胞中存在mTOR-Bim、Caspase-Bim負反饋調控。Matsumoto等[21]對利塞膦酸鹽骨保護機制的研究顯示，破骨細胞敲除bim及轉染促分裂原活化的蛋白激酶激酶1均可抑制利塞膦酸鹽的破骨細胞凋亡誘導作用，但無法抑制利塞膦酸鹽的骨保護作用，而只有轉染蛋白激酶B(Akt)能夠促進骨吸收；利塞膦酸鹽在bim-/-小鼠中起著與野生型小鼠相同的骨保護作用：證實ERK/Bim通路調控小鼠破骨細胞凋亡，而Akt通路可能通過細胞骨架調控破骨細胞骨吸收。

2.3.2Bim在成骨細胞中的作用及調節機制 成骨細胞形成新骨是骨改建的完成階段。成骨細胞凋亡在骨改建過程中同樣發揮作用，而Bim是成骨細胞凋亡的重要調節因子[33]。Espina等[34]證實，生理狀態下小鼠前成骨細胞系小鼠骨髓間質細胞中促凋亡蛋白Bim表達很低，高濃度腎上腺皮質激素作用24～48 h后Bim的表達增高，同時伴有大量細胞凋亡，且隨著腎上腺皮質激素作用時間及濃度的增加，Bim的表達及細胞凋亡也隨之上調；siRNA干擾bim表達可降低小鼠骨髓間質細胞凋亡比例。血清饑餓致成骨細胞凋亡機制的研究進一步證實Bim在介導成骨細胞凋亡過程中起關鍵作用[35]。Kawamura等[36]在血清饑餓誘導小鼠前成骨細胞MC3T3-E1凋亡中同樣證實，Bim表達呈時間依賴性升高，而Bax、Bcl-2及Bcl-xL表達均未發生改變；siRNA干擾bim后活化的胱天蛋白酶3表達也隨之降低。以上研究說明，Bim介導成骨細胞凋亡。

Bim在成骨細胞凋亡中存在多水平調節。Espina等[34]證實，血清饑餓從基因水平上調成骨細胞Bim mRNA表達。Kawamura等[36]進一步對Bim基因水平調節的研究表明，叉頭樣轉錄因子O3a結合bim啟動子后可啟動其轉錄，增強轉錄活性，而Akt1可通過磷酸化叉頭樣轉錄因子O3a、阻止其核轉移而抑制bim轉錄活性及成骨細胞凋亡，另一方面敲除Akt1(Akt1-/-)的成骨細胞叉頭樣轉錄因子O3a磷酸化減弱、核轉移降低、成骨細胞凋亡率下降。Purev等[32]同樣發現ERK/蛋白激酶B抑制Bim mRNA及蛋白表達，推斷ERK/蛋白激酶B通路下調Bim基因表達。Guo等[37]敲除成骨細胞miR-17～92a可促進地塞米松誘導的成骨細胞凋亡，而過表達miR-17～92a可加強雌激素對成骨細胞的抗凋亡作用，進一步研究發現miR-17～92a可與Bim 3′-非翻譯區域結合而抑制Bim表達。Liang等[35]在成骨細胞凋亡中發現Bim受蛋白水平調節。蛋白合成后，蛋白酶體抑制劑MG132可顯著上調成骨細胞Bim的表達，提示Bim受蛋白酶體的降解調控[35]。

3 小 結

骨改建包括骨形成與骨吸收，兩者的平衡對骨穩態十分重要。目前的研究已證實，除在破骨細胞凋亡中發揮重要作用外，Bim對破骨細胞的骨吸收能力也有一定的影響，但具體機制尚不清楚。Bim在破骨細胞凋亡中存在c-Cbl介導的泛素化蛋白酶體降解調控，但基因水平及蛋白合成水平調控目前尚未證實。與破骨細胞相比，生理狀態下成骨細胞中Bim的表達很低；而在腎上腺素、血清饑餓等刺激下，Bim表達上調并伴有細胞凋亡。Bim同樣介導成骨細胞凋亡并存在多水平、多層次調節。

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