結(jié)腸癌微環(huán)境對骨髓間充質(zhì)干細胞形態(tài)、增殖及CD13、CD133表達的影響

景 明，陳正君，王雅莉，張艷霞，劉雪楓

（1.甘肅中醫(yī)學(xué)院，甘肅蘭州730000；2.甘肅省中藥藥理與毒理學(xué)重點實驗室，甘肅蘭州730000）

·實驗研究·

結(jié)腸癌微環(huán)境對骨髓間充質(zhì)干細胞形態(tài)、增殖及CD13、CD133表達的影響

景 明1，2，陳正君1，王雅莉1，張艷霞1，2，劉雪楓1

（1.甘肅中醫(yī)學(xué)院，甘肅蘭州730000；2.甘肅省中藥藥理與毒理學(xué)重點實驗室，甘肅蘭州730000）

目的觀察結(jié)腸癌微環(huán)境對骨髓間充質(zhì)干細胞（BMSCs）形態(tài)、增殖及CD13、CD133表達的影響。方法對照組為BMSCs單獨培養(yǎng)，實驗組采用Transwell小室建立BMSCs與結(jié)腸癌SW480細胞非接觸、共培養(yǎng)的微環(huán)境。顯微鏡觀察BMSCs的形態(tài)變化，四氮唑蘭比色法（MTT）檢測BMSCs增殖情況，流式細胞儀檢測其周期及表面抗原的表達。結(jié)果與對照組比較，實驗組BMSCs的形態(tài)具備了惡性腫瘤細胞的特點，增殖速度增高，其S期細胞含量（41.1%）較對照組（9.67%）明顯增加；實驗組BMSCs的CD13的表達為89.7%±9.5%，明顯高于對照組的67.1% ±8.1%（P＜0.01）；實驗組BMSCs的CD133的表達為90.5%±6.4%，明顯高于對照組的4.3%±1.2%（P＜0.01）。結(jié)論應(yīng)用Transwell小室可實現(xiàn)結(jié)腸癌SW480細胞和BMSCs非接觸共培養(yǎng)，并能誘導(dǎo)BMSCs細胞發(fā)生惡性轉(zhuǎn)化，其機制與引起細胞形態(tài)、增殖能力及細胞表面標(biāo)記物等生物學(xué)特性的改變有關(guān)。

結(jié)腸癌微環(huán)境；骨髓間充質(zhì)干細胞；細胞周期；CD13和CD133

骨髓間充質(zhì)干細胞（bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs）是一群來源于骨髓組織中的多能干細胞，具有多向分化潛能，易于體外分離并培養(yǎng)，具有極好的遷移能力及腫瘤趨向性和低免疫原性，是理想的組織工程種子細胞［1，2］。然而，隨著近年來對BMSCs生理特性和腫瘤研究的不斷深入，卻發(fā)現(xiàn)BMSCs經(jīng)長期培養(yǎng)，尤其在腫瘤微環(huán)境中可能發(fā)生惡性轉(zhuǎn)化，從而進一步促進腫瘤的發(fā)生、發(fā)展［3，4］。為此，本實驗采用Transwell小室建立BMSCs與結(jié)腸癌細胞SW480非接觸共培養(yǎng)的模擬腫瘤微環(huán)境，對微環(huán)境中BMSCs形態(tài)、增殖及細胞表型等相關(guān)生物學(xué)特性進行研究，為進一步了解BMSCs在重塑的腫瘤微環(huán)境中生物學(xué)行為的變化提供參考依據(jù)。

1 實驗材料

1.1 動物 健康雄性SPF級Wistar大鼠，體重（180±20）g，由甘肅中醫(yī)學(xué)院科研實驗中心提供，動物合格證號：SCXK（甘）2001－0001－0001332，動物實驗設(shè)施使用證號：SYXK（甘）2001－0001－0000390。

1.2 細胞株 結(jié)腸癌SW480細胞株購自江蘇江陰齊氏生物科技有限公司。

1.3 主要試劑 胎牛血清、DMEM培養(yǎng)基和0.25%胰蛋白酶（trypsin，Hyclone公司）；二甲亞砜（DMSO，美國Amresco公司）；碘化丙啶（PI，美國Sigma公司），四甲基偶氮唑藍（MTT，美國Sigma公司）。

1.4 主要儀器 細胞培養(yǎng)箱（日本三洋電機公司），倒置相差顯微鏡（日本Olympus公司），流式細胞儀（美國Becton Dickin－son公司），熒光顯微鏡及攝像系統(tǒng)（日本Nekon90I公司），Transwell插入式培養(yǎng)皿（美國Millicell公司），細胞計數(shù)板（南京建成生物工程研究所），酶標(biāo)儀（美國Thermo公司）。

2 方法

2.1 BMSCs的分離培養(yǎng) Wistar大鼠經(jīng)頸椎脫臼法處死后，無菌條件下剝離肌肉，分離股骨及脛骨，剪去兩端軟骨暴露出骨髓腔，隨后用注射器吸取DMEM培養(yǎng)液沖洗骨髓腔2～3次，收集沖洗液至離心管。1 000 rpm離心10 min，棄上清，制成細胞懸液，接種于50 mL培養(yǎng)瓶，置于37℃、飽和濕度、5% CO2孵箱中培養(yǎng)。48 h后換液，去除未黏附的細胞，以后每3天更換培養(yǎng)液一次。

待細胞生長至80%～90%融合時，按照1∶2比例傳代，培養(yǎng)液為含10%胎牛血清和青、鏈霉素各100 U·mL－1的DMEM培養(yǎng)液，2～3日更換培養(yǎng)液一次，根據(jù)生長情況傳至3～4代，用臺盼藍測定細胞活力在95%以上時進行下一步實驗。

2.2 分組

2.2.1 對照組 第4代的BMSCs置于37℃、5% CO2孵箱中用含10%胎牛血清和青、鏈霉素各100 U·mL－1的DMEM培養(yǎng)液單獨培養(yǎng)。

2.2.2 實驗組 BMSCs與SW480非接觸共培養(yǎng)。采用有PET膜的Transwell懸掛式培養(yǎng)小室結(jié)合6孔板進行培養(yǎng)，將第4代BMSCs細胞接種于放有小室的6孔板內(nèi)，小室內(nèi)種植SW480細胞，調(diào)整兩種細胞的比例為1∶1，培養(yǎng)液為含10%胎牛血清和青、鏈霉素各100 U·mL－1的DMEM培養(yǎng)液，每24 h更換培養(yǎng)液一次。培養(yǎng)環(huán)境為37℃、5%CO2孵箱。以上兩組處于對數(shù)生長期的BMSCs細胞，用含0.25%胰蛋白酶消化，制成l×106個·mL－1左右單細胞懸液檢測指標(biāo)。

2.3 指標(biāo)檢測

2.3.1 MTT法檢測細胞增殖 用計數(shù)板計數(shù)，將細胞懸液濃度調(diào)整為1×104個·mL－1，接種于96孔板，每孔200μL，置恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每3天換液。在一周內(nèi)每天每組取1孔進行計數(shù)，另外每組各取3孔分別加入20μLMTT（5 mg·mL－1），繼續(xù)孵育4 h后小心棄去液體，每孔內(nèi)加入150μL DMSO，搖床上低速震蕩10 min。在490 nm處用酶標(biāo)儀測定各孔的吸光度（A）值，再根據(jù)吸光度和細胞計數(shù)的關(guān)系，繪制細胞生長曲線，并計算結(jié)腸癌微環(huán)境對BMSCs生長的增殖率，增殖率（%）＝（實驗－對照）／對照×100%。

2.3.2 流式細胞儀檢測細胞表面抗原 取潔凈的塑料試管，分別加入熒光標(biāo)記小鼠抗人單克隆抗體CD13和CD133各20μL，每管加入細胞懸液100μL，混合均勻，室溫下孵育30 min。每管加入1.5 mL PBS，充分混勻，1 800 rpm離心5 min后棄上清，每管加200μL PBS?；靹蚝?，流式細胞儀檢測，用Apple隨機軟件進行分析，每個樣本分析10 000個細胞。

2.3.3 細胞周期檢測 將細胞懸液轉(zhuǎn)移至預(yù)裝2 mL DMEM培養(yǎng)液的離心管中，以5 000 rpm轉(zhuǎn)速離心3 min。棄棄去上清液，用2 mL PBS洗滌細胞沉淀，以0.8 mL預(yù)冷PBS制備單細胞懸液（2×106個·mL－1），邊振蕩邊逐滴加入2.4 mL預(yù)冷至4℃的無水乙醇進行細胞固定。4℃冰箱固定24 h，再用冷PBS液洗滌細胞兩次去除固定液，加300～500 μL碘化丙啶染液，在室溫下避光放置20 min以上。用流式細胞儀進行細胞周期檢測。

2.4 統(tǒng)計學(xué)分析 應(yīng)用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件分析結(jié)果。計量資料結(jié)果采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差±s）表示，組間比較用配對樣本的t檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 BMSCs形態(tài)鑒定 骨髓間充質(zhì)干細胞在貼壁培養(yǎng)48 h后細胞的形態(tài)表現(xiàn)為：可見散在貼壁細胞，細胞排列紊亂，呈長梭形或多角形，細胞之間通過突起相連接，細胞的兩極朝向不規(guī)律；7～10 d后，呈梭形或長多邊形，貼壁細胞體積增大，細胞數(shù)目明顯增多，形態(tài)不完全均一，但細胞排列整齊，邊界清晰，在培養(yǎng)瓶中分布及生長均勻。原代培養(yǎng)10～14 d細胞可達80%～90%融合，經(jīng)過3代后骨髓間充質(zhì)干細胞形態(tài)大體相似（見圖1、2）。

圖1 第三代骨髓間充質(zhì)干細胞（×100）

圖2 第三代骨髓間充質(zhì)干細胞（×200）

3.2 共培養(yǎng)后BMSCs的細胞形態(tài) 共培養(yǎng)后骨髓間充質(zhì)干細胞中有部分細胞出現(xiàn)圓形的形態(tài)改變（見圖3）。用限制稀釋法繼續(xù)培養(yǎng)后，骨髓間充質(zhì)干細胞形態(tài)不一，細胞較大，胞核增大，核大小、形狀和染色不一，并可見巨核、雙核、異型核、多核等，具備了惡性腫瘤細胞的特點（見圖4）。

圖3 共培養(yǎng)后骨髓間充質(zhì)干細胞的形態(tài)（Bar，100μm）

圖4 繼續(xù)共培養(yǎng)后骨髓間充質(zhì)干細胞（Bar，200μm）

3.3 BMSCs表面抗原檢測 流式細胞技術(shù)檢測BMSCs表面標(biāo)記物，結(jié)果表明，實驗組BMSCs的CD13和CD133的陽性表達均高于對照組（見表1）。

表1 結(jié)腸癌微環(huán)境對骨髓間充質(zhì)干細胞CD13和CD133表達的影響（±s）

表1 結(jié)腸癌微環(huán)境對骨髓間充質(zhì)干細胞CD13和CD133表達的影響（±s）

注：與對照組比較，*P＜0.01

表面抗原 CD13 CD133對照組（%）67.12±8.10 4.33±1.24實驗組（%） 89.73±9.51* 90.50±6.42*

3.4 BMSCs生長曲線和細胞周期 MTT結(jié)果顯示，BMSCs和結(jié)腸癌SW480細胞共培養(yǎng)后，其增殖速度明顯高于對照組（見表2、圖5）。

表2 結(jié)腸癌微環(huán)境對骨髓間充質(zhì)干細胞增殖率的影響（%，±s）

表2 結(jié)腸癌微環(huán)境對骨髓間充質(zhì)干細胞增殖率的影響（%，±s）

注：與對照組同時間增長率比較，*P＜0.01

時間（d）1 2 3 4 5 6 7對照組（%） 8.57±2.26 48.57±3.88 71.43±4.10 85.71±6.66 91.43±7.71 111.43±8.22 117.14±8.01實驗組（%） 17.14±2.10* 62.86±3.35*100.00±5.66*122.86±5.20*148.57±4.85*157.14±7.84*182.86±7.92*

3.5 BMSCs細胞周期 流式細胞儀檢測結(jié)果顯示，對照組BMSCs各周期比例分別為G0／G1：78.65%±1.12%，G2／M：11.68%±0.34%，S：9.67% ±0.20%；與SW480細胞共培養(yǎng)后，BMSCs各周期比例分別為G0／G1：48.82%±0.47%，G2／M：10.08%± 0.13%，S：41.1%±0.26%。實驗組BMSCs處于靜止期（G0／G1）的細胞比例低于對照組（P＜0.01），而處于增殖期（G2／M、S）的細胞比例明顯高于對照組（P＜0.01）（見圖6、7）。

4 討論

隨著對間充質(zhì)干細胞（marrow mesenchymalstem cells，MSCs）研究的不斷深入，越來越多的干細胞成瘤的現(xiàn)象被報道［5，6］。Rubio等［7］報道將體外培養(yǎng)8個月內(nèi)、分裂90～140次的間充質(zhì)干細胞移植入動物體內(nèi)會引起腫瘤產(chǎn)生。他們也發(fā)現(xiàn)體外擴增6～8周的人MSCs是安全的，但經(jīng)過4～5月長時間培養(yǎng)后，間充質(zhì)干細胞可發(fā)生惡性轉(zhuǎn)化。Miura等［8］將鼠骨髓間充質(zhì)干細胞經(jīng)過一年以上連續(xù)傳代后，獲得無限群體倍增數(shù)，發(fā)生惡性轉(zhuǎn)化，形成纖維肉瘤，進一步通過尾靜脈注射入裸鼠體內(nèi)后形成腫瘤；但同樣的條件下培養(yǎng)的人間充質(zhì)干細胞卻沒有發(fā)生惡性轉(zhuǎn)化。因此，MSCs的惡性轉(zhuǎn)化，目前尚存在爭議。

圖5 結(jié)腸癌微環(huán)境對BMSCs增殖率的影響（±s）

圖6 單獨培養(yǎng)后對照組各細胞周期（±s）

圖7 共培養(yǎng)后實驗組各細胞周期（±s）

腫瘤微環(huán)境能調(diào)控腫瘤細胞和骨髓間充質(zhì)干細胞的增殖、分化等多種生物學(xué)行為［9］，但對其相互作用規(guī)律及其機理，目前還缺乏系統(tǒng)的認識。本實驗利用Transwell小室建立骨髓間充質(zhì)干細胞與結(jié)腸癌細胞非接觸共培養(yǎng)體系，以此系統(tǒng)模擬結(jié)腸癌微環(huán)境，來探討結(jié)腸癌微環(huán)境對BMSCs生物學(xué)特性的影響。CD13又稱為氨肽酶N，表達于腫瘤干細胞，在腫瘤細胞的生長、浸潤和轉(zhuǎn)移等過程中發(fā)揮重要作用［10］；CD133是分子量為120 kD的糖蛋白，近年來，越來越多的證據(jù)表明，CD133可能是腫瘤干細胞表面的特異性分子，并且極有可能成為治療腫瘤的一個有效的靶點［11］。

本實驗研究表明，結(jié)腸癌細胞SW480和BMSCs共培養(yǎng)后，BMSCs細胞形態(tài)不一，體積增大，胞核也增大，并可見巨核、雙核、多核、異型核等細胞，具備了惡性腫瘤細胞的形態(tài)特點。進一步研究表明，實驗組BMSCs的CD13和CD133的陽性表達均高于對照組，同時實驗組BMSCs的增殖能力也明顯強于對照組，S期（增殖期）細胞比例明顯高于對照組。提示腫瘤微環(huán)境可誘導(dǎo)BMSCs分化，發(fā)生惡性轉(zhuǎn)化，其機制可能與引起增殖能力、細胞表面標(biāo)記物及細胞形態(tài)等生物學(xué)特性的改變有關(guān)。

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Influence of colon carcinoma m icroenvironment on cellmorphology，proliferation and expressions of CD13and CD133of bonemarrow mesenchymal stem cells

JINGMing1，2，CHEN Zheng-jun1，WANG Ya-li1，ZHANG Yan-xia1，2，LIU Xue-feng1
（1.Gansu College of Traditional Chinese Medicine，Lanzhou 730000，China；2.China Key Laboratory of Traditional Chinese Medicine Pharmacology and Toxicology of Gansu Province，Lanzhou 730000，China）

ObjectiveTo investigate the effect of Colon carcinomamicroenvironment on cellmorphology，proliferation and expressions of CD13and CD133of bonemarrow mesenchymal stem cells.MethodsControl group was bonemarrow derived stroma cells cultured in DMEM medium，experimentalgroup was（BMSCs）SW480 cells and bonemarrow derived stroma cell（BMSCs）co－cultured in transwell chamber.The cellmorphology of BMSCs was observed by microscope，and the generation of BMSCswere detected by MTTmethod.Cell cycle and expressions of CD13and CD133were analyzed by flow cytometry（FCM）.ResultsCompared with control group，BMSCs in experimental group had the feature ofmalignant tumor cells，the generation speed significantly quicker and the percentage of Sphasewas significantlymore than control group，The expressions of CD13in experimental group（89.7%±9.5%）were significantly higher than control group（67.1%±8.1%）（P＜0.01），and the expressions of CD133in experimental group（90.5%±6.4%）were significantly higher than control group（4.3%±1.2%）（P＜0.01）.ConclusionThese findings suggested that transwell chamber can help to achieve cocultivation of SW480 cells and BMSCs and inducemalignant transformation of BMSCs cell，themechanism could be related to the changes of bionomics such as cellmorphology，reproductive activity and cell surfacemarker.

Colon carcinomamicroenvironment；BMSCs；Cell cycle；CD13and CD133

R730.23

A

2095－5375（2014）09－0497－005

國家自然科學(xué)基金項目（No.81360522）

景明，男，教授，研究方向：中藏藥新制劑研究，E－mail：jm＠gszy.edu.cn

陳正君，男，研究方向：中藏藥新制劑研究，Tel：0931－8765458，E－mail：547649265＠qq.com