以尿鈣排泄量為效應指標評價枸櫞酸氫鉀鈉顆粒人體生物等效性

張 華，劉 沙，李 榮，王本杰，郭瑞臣

（1.山東大學藥學院，山東濟南250012；2.山東萬杰醫學院藥學教研室，山東淄博255213；3.山東大學齊魯醫院臨床藥理研究所，山東濟南250012）

以尿鈣排泄量為效應指標評價枸櫞酸氫鉀鈉顆粒人體生物等效性

張 華1，2，3，劉 沙3，李 榮3，王本杰3，郭瑞臣3

（1.山東大學藥學院，山東濟南250012；2.山東萬杰醫學院藥學教研室，山東淄博255213；3.山東大學齊魯醫院臨床藥理研究所，山東濟南250012）

目的以24 h尿液鈣離子累計排泄量為指標，比較國產和進口枸櫞酸氫鉀鈉顆粒劑的生物等效性。方法36名男性健康志愿者按自身交叉設計，隨機口服枸櫞酸氫鉀鈉顆粒劑的受試制劑（國產）或參比制劑（進口）5.0 g，（洗脫期7 d）。分別收集給藥前（空白）和給藥后0～2、2～4、4～6、6～8、8～10，10～12、12～24 h的尿液，記錄尿量，采用原子吸收分光光度法測定尿液鈣離子濃度，計算給藥前、后24 h尿液鈣累積排泄量。結果受試制劑給藥前、后24 h尿鈣累積排泄量為（128.47±76.45）mg和（163.53±81.28）mg；參比制劑給藥前、后24 h尿鈣累積排泄量為（128.34±59.55）mg和（179.65±103.96）mg。給予受試制劑和參比制劑后24 h尿鈣排泄量分別比用藥前增加（35.06±61.26）mg和（51.31±73.18）mg，兩制劑間沒有顯著性差異（P＞0.05）。結論國產和進口枸櫞酸氫鉀鈉顆粒劑具有生物等效性，尿液鈣離子累計排泄量可用于國產和進口枸櫞酸氫鉀鈉顆粒劑生物等效性評價。

枸櫞酸氫鉀鈉顆粒；參比制劑；受試制劑；鈣；生物等效性；原子吸收分光光度法

泌尿系統結石是影響人類健康的一種嚴重疾病，低枸櫞酸癥和高鈣是引起結石的主要原因，口服枸櫞酸氫鉀鈉可降低尿液鈣離子濃度，增加尿液pH值和枸櫞酸根濃度［1］。通過增加尿酸和胱氨酸結石的可溶性，溶解尿酸結石，防止新的結石的形成［2］。臨床主要用于胱氨酸結石和胱氨酸尿的維持治療。本試驗采用簡便、靈敏的火焰原子吸收分光光度計法測定尿液鈣濃度［3］，以尿鈣累積排泄量為指標，評價國產枸櫞酸氫鉀鈉顆粒劑（受試制劑）與進口枸櫞酸氫鉀鈉顆粒劑（參比制劑）的生物等效性［4］，為其新藥注冊和臨床應用提供試驗依據。

1 材料和方法

1.1 藥品、試劑和儀器 枸櫞酸氫鉀鈉顆粒受試制劑［A，規格：2.43 g／2.5 g（以K6Na6H3（C6H5O7）5計），2.5 g／袋，批號：1007901，山東京衛制藥有限公司］；枸櫞酸氫鉀鈉顆粒參比制劑［R，規格：97.1 g／100 g，100 g／聽，批號：0918638，德國馬博士大藥廠生產（商品名友來特）］。娃哈哈飲用純凈水（批號：20110713，杭州娃哈哈集團有限公司生產）；鈣標準溶液（1 000μg·mL－1，批號：GSB07－1263－2000，國家標準物質研究中心）；硝酸（優級純65%～68%，批號：20060807，上海試劑四廠）；氧化鑭（高純試劑，批號：F200090219，國藥集團化學試劑有限公司）。Solaar M－6原子吸收分光光度計（英國Thermo Elemental公司，）；WM－2H型無油氣體壓縮機（天津市醫療器械二廠）；Sartorius BS224S電子天平（量程220 g，精度0.1 mg，北京賽多利斯儀器系統有限公司）。

1.2 受試者選擇 健康男性志愿者36名，年齡（24.9±1.06）歲，體重（67.1±6.12）kg，統一進行查體及實驗室檢查。所有志愿者無心、肝、腎、消化道、精神神經系統異常，非過敏性體質，無藥物過敏史，試驗前2周內無用藥史，3個月內未用過已知對某臟器有損害的藥物，所有受試者自愿參加試驗并簽署知情同意書。

1.3 試驗設計 根據枸櫞酸氫鉀鈉顆粒臨床試驗批件要求和國家新藥審評中心《化學藥物制劑人體生物利用度和生物等效性研究的技術指導原則》，設計枸櫞酸氫鉀鈉顆粒人體生物等效性研究方案，試驗方案經山東大學齊魯醫院國家藥品臨床研究機構倫理委員會批準。試驗于山東大學齊魯醫院國家藥品臨床研究機構Ⅰ期臨床試驗病房內進行，具有相應娛樂設施和休息場所。試驗過程有相應的醫療保護和搶救措施，主要研究者具備相應研究資質和豐富經驗，可充分保證受試者安全和試驗的順利進行。

采用單劑口服雙周期、雙交叉試驗設計。36名受試者按體重分層后隨機分為兩組，每組18人。試驗期間統一進食標準餐，飲用純凈水，禁食補鈣制劑及對胃腸強刺激性食物，保證每日提供鈣9.35 mmol，使鈣的攝入和排出趨于穩定。受試者試驗前二日入住Ⅰ期病房，試驗前一日采集受試者給藥前（空白期）尿液，試驗日晨7∶00，單次口服受試制劑或參比制劑5.0 g，250 mL溫開水溶解送服，收集給藥后尿液。

試驗前后尿液分段采集，分別為0～2、2～4、4～6、6～8、8～10，10～12、12～24 h，記錄尿液體積，留取10 mL，分雙份－20℃冷凍待測。清洗期為7 d，于第8天兩組志愿者交叉服藥，進行第二周期試驗。

1.4 尿液鈣離子濃度測定 采用原子吸收分光光度計測定尿液中鈣離子的濃度。儀器參數燈電流：4 mA，檢測波長：422.7 nm，光譜通帶寬度：0.5 nm，火焰類型為Air－C2H2，燃氣流量：1.4 L·min－1，燃燒器高度：11.0 mm。

尿樣室溫中融化，取1mL加入5mL比色管中，加入1 mL硝酸，混勻，放置5 min，水定容至刻度。混勻后取1mL溶液，置于5 mL容量瓶中，用氧化鑭溶液定容至刻度，混勻，上機測定。

2 結果

2.1 方法學考察

2.1.1 標準曲線建立 分別精密量取0.05、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL鈣標準溶液，置100 mL容量瓶中，加20 mg·mL－1氧化鑭溶液至刻度，搖勻。配制成濃度為0.5、1、2、4、6、8、10μg·mL－1鈣標準溶液，進樣測定相應吸光度，每個濃度測5次。以鈣濃度作為X，相對應的吸光度值作為Y，進行線性回歸，得回歸方程Y＝0.025 0＋0.040 01X（r＝0.999 8，線性范圍為0.5～10μg·mL－1），最低定量限為0.5μg·mL－1。

2.1.2 精密度和回收率 分別精密量取0.05、0.5、0.9 mL鈣標準溶液，置于100 mL容量瓶中，加20μg·mL－1氧化鑭溶液到刻度，搖勻。每個濃度于1 d內測定25次，考察批內精密度。每個濃度連續測定3 d，每天測定25次，考察批間精密度；根據測定濃度計算尿鈣相對回收率。方法精密度良好，批內、批間精密度均＜5%；回收率均101%～105%，可滿足尿鈣測定要求。

2.1.3 穩定性 取低、中、高（0.5、5、9μg·mL－1）濃度的質控樣品，分別測定室溫放置7 d、14 d、－20℃存放15 d、－20℃存放24 h凍融2次的穩定性。結果表明，鈣標準溶液室溫7 d、14 d，－20℃存放15 d及－20℃存放24 h凍融2次均穩定，相對標準偏差（RSD%）在0.4%～3.7%內。

2.2 24 h尿量、尿鈣濃度和尿鈣排泄量 5.0 g枸櫞酸氫鉀鈉顆粒試驗制劑和參比制劑給藥前、后24 h各時間段尿量、尿鈣濃度及尿鈣排泄量，見表1、2。

表1 給受試制劑前后尿量、尿鈣濃度（n＝36，±s）

表1 給受試制劑前后尿量、尿鈣濃度（n＝36，±s）

時間（h）用藥前 用藥后尿量（mL）鈣濃度（g·mL－1）尿量（mL）鈣濃度（g·mL－1）4 49.81±63.16 2～4 263.89±147.6 67.97±71.32 337.42±210.80 52.63±46.83 4～6 229.47±140.34 84.89±49.07 399.33±218.66 80.43±41.84 6～8 337.61±178.57 43.42±32.35 390.39±194.05 55.34±34.46 8～10 370.22±212.37 48.10±36.70 524.06±254.21 42.97±25.34 10～12 291.33±166.55 49.88±38.48 418.22±215.24 56.92±42.42 12～24 487.25±253.76110.55±71.77 673.58±38 0～2 216.64±125.28 63.37±56.16 340.33±215.5 5.90 59.34±35.22

表2 給參比制劑前后尿量、尿鈣濃度（n＝36，±s）

表2 給參比制劑前后尿量、尿鈣濃度（n＝36，±s）

時間（h）用藥前 用藥后尿量（mL）鈣濃度（g·mL－1）尿量（mL）鈣濃度（g·mL－1）0 45.82±28.30 2～4 217.28±143.83 82.11±80.46 368.22±175.73 61.31±50.53 4～6 240.61±185.28 87.95±64.78 352.86±187.06 76.10±46.18 6～8 257.44±156.49 77.54±75.46 387.78±215.61 59.22±39.05 8～10 356.75±202.75 49.30±64.62 440.53±198.45 56.60±48.23 10～12 334.83±181.71 47.48±39.62 414.47±194.72 66.14±45.87 12～24 583.44±318.00 90.02±56.08 609.81±323 0～2 216.53±128.98 66.64±40.75 332.72±190.7.67 81.98±52.78

2.3 不同周期24 h尿鈣累積排泄量 見表3。

表3 參比制劑（R）和受試制劑（A）不同周期24 h尿鈣累積排泄量（mg）

2.4 受試和參比制劑生物等效性的評價 36名志愿者口服受試和參比枸櫞酸氫鉀鈉顆粒劑前、后24 h尿鈣累積排泄量見表4。可見用枸櫞酸氫鉀鈉顆粒劑的參比制劑后24 h尿鈣累積排泄量比用藥前明顯增加，差別有顯著意義（P＜0.01）；用枸櫞酸氫鉀鈉顆粒劑的受試制劑后24 h尿鈣累積排泄量也比用藥前明顯增加，差別有顯著意義（P＜0.05）。但由受試制劑引起尿鈣排泄的增加量與參比制劑比較，沒有顯著性差異（P＞0.05）。36名健康志愿者分別服試驗制劑和受試制劑后，各時間區間尿量、尿鈣排泄量均值與用藥前相比，部分不同程度增加，沒有顯著性差異（P＞0.05），結果見表5、6。綜上，說明枸櫞酸氫鉀鈉顆粒劑的受試制劑和受試制劑具有生物等效應。

表4 口服受試和參比枸櫞酸氫鉀鈉顆粒劑前、后24 h尿鈣累積排泄量（mg，n＝36，±s）

表4 口服受試和參比枸櫞酸氫鉀鈉顆粒劑前、后24 h尿鈣累積排泄量（mg，n＝36，±s）

用藥前參比制劑 128.34±59.55 179.65±103.96*藥物 用藥前 用藥后 用藥后－51.31±73.18受試制劑 128.47±76.45 163.53±81.28**35.06±61.26

注：*P＜0.01，**P＜0.05，與用藥前比較

表5 參比制劑（R）和受試制劑（A）不同時間區間尿鈣差值（mg）

表6 參比制劑（R）和受試制劑（A）不同時間區間尿量差值（mL）

3 討論

枸櫞酸氫鉀鈉口服可降低尿液鈣離子濃度，增加尿液pH值和枸櫞酸根濃度。低鈣離子濃度可降低尿液中能形成結石的鈣鹽飽和度，降低尿液中形成鈣鹽結石的可能性；高pH值能增加尿酸和胱氨酸結石的可溶性，溶解尿酸結石，防止新的結石的形成。

某些內源性物質如鉀離子由于機體存在自穩機制，在一定范圍內血濃度相對恒定，難以獲得理想的血藥濃度－時間數據［5］。本試驗以給藥前后24 h鈣排泄量增加值為指標，評價枸櫞酸氫鉀鈉口服制劑的生物等效性。

鈣離子為體液中固有的電解質成分，屬內源性物質，血鈣水平受飲食等生理因素的影響。因此，采用平衡飲食、給藥前后對比的方法，計算給藥前后24 h鈣排泄量增加值。尿藥累積排泄法非創傷性取樣，易為受試者接受，尿液量大，成分簡單，干擾成分少［6，7］。但可變因素多，如易受飲水量、尿量收集的完整性影響。

本試驗參照FDA文件設立一定時間的飲食平衡期和基線期，受試者在整個兩周期的試驗中都嚴格的定時定量接受標準飲食和純凈水，測定尿鈣離子基線水平。口服枸櫞酸氫鉀鈉制劑后，檢測尿鈣濃度，其變化可以反映枸櫞酸氫鉀鈉降低尿液鈣離子的作用［8］。

枸櫞酸氫鉀鈉為尿石癥常用治療藥物，口服可降低尿液鈣離子濃度，增加尿液pH值和枸櫞酸根濃度。本試驗結果顯示，健康志愿者空腹口服枸櫞酸氫鉀鈉顆粒劑的受試制劑與參比制劑后，尿液鈣離子濃度均降低，24 h尿液鈣累積排泄量與用藥前相比，有不同程度增加，但2種制劑引起的增量無顯著性差異（P＞0.05），符合生物等效性的統計學要求以及兩制劑生物等效的假設，枸櫞酸氫鉀鈉受試制劑與參比制劑生物等效。

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Evaluation of the bioequivalence of domestic and im ported Potassium Sodium Hydrogen Citrate Granulesw ith accumulative urinary excretion of calcium as index in healthy volunteers

ZHANG Hua1，2，3，LIU Sha3，LIRong3，WANG Ben-jie3，GUO Rui-chen3
（1.School of Pharmaceutical Sciences，Shandong University，Jinan 250012，China；2.Department of Pharmacy，Shandong Wanjie Medical College，Zibo 255213，China；3.Institute of Clinical Pharmacology，Qilu Hospital，Shandong University，Jinan 250012，China）

ObjectiveTo evaluate the bioequivalence of imported and domestic Potassium Sodium Hydrogen Citrate Granules with accumulative urinary excretion of calcium as index in Chinese healthy volunteers.MethodsThirty－six healthymale volunteers were randomLy administered with a oral single dose of5.0 g domestic（test）and imported（reference）Potassium Sodium Hydrogen Citrate Granules in a crossover study with a washout period of7 days.Urinewas collected before or after oral doses at the scheduled time（0～2，2～4，4～6，6～8，8～10，10～12，12～24 h）.Urine volumes were recorded，urinary calcium concentration was determined by atomic absorption spectrophotometric and twenty－four hours of accumulative urinary excretion of calcium were calculated.ResultsTwenty－four hours of accumulative urinary excretion of calcium were（128.47±76.45）mg and（163.53±81.28）mg before and after taking test preparation；（128.34 ±59.55）mg and（179.65±103.96）mg before and after taking reference preparation，respectively.Increase in 24 h urinary excretion of calcium after taking test and reference preparation were（35.06±61.26）mg and（51.31±73.18）mg，respectively.There was no significant difference（P＞0.05）in increase of24 h accumulative urinary excretion of calcium between the two preparations.ConclusionThe domestic and imported Potassium Sodium Hydrogen Citrate Granuleswere bioequivalent.

Potassium Sodium Hydrogen Citrate Granules；Reference preparation；Test preparation；Calcium；Bioequivalence；Atomic absorption spectrophotometry

R944

A

2095－5375（2014）09－0501－004

張華，女，講師，研究方向：藥物分析，E－mail：zhanghua0216＠126.com

郭瑞臣，教授，博士研究生導師，研究方向：臨床藥理學，Tel：0531－82169636，E－mail：grc7636＠126.com