綠原酸對佐劑性關(guān)節(jié)炎模型大鼠抗炎作用及機制研究

徐英輝，申 茹，劉彥彥

（1.惠州衛(wèi)生職業(yè)技術(shù)學(xué)院，廣東惠州，516025；2.銅仁職業(yè)技術(shù)學(xué)院，貴州銅仁554300）

綠原酸對佐劑性關(guān)節(jié)炎模型大鼠抗炎作用及機制研究

徐英輝1，申 茹1，劉彥彥2

（1.惠州衛(wèi)生職業(yè)技術(shù)學(xué)院，廣東惠州，516025；2.銅仁職業(yè)技術(shù)學(xué)院，貴州銅仁554300）

目的探討綠原酸對佐劑性關(guān)節(jié)炎模型動物抗炎作用及機制。方法采用大鼠足跖注射Freund′s完全佐劑形成佐劑性關(guān)節(jié)炎（AA），隨機分為空白對照組、模型組、陽性對照組（尼美舒利）、綠原酸低劑量組（25 mg· kg－1）、中劑量組（50 mg·kg－1）和高劑量組（100 mg·kg－1）。觀察綠原酸對佐劑性關(guān)節(jié)炎模型大鼠超敏反應(yīng)與左右足跖寬度、血清腫瘤壞死因子（TNF－α）、白細(xì)胞介素－2（IL－2）、循環(huán)免疫復(fù)合物（CIC）、超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH－Px）和丙二醛（MDA）的含量。結(jié)果綠原酸中劑量組（50 mg·kg－1）、高劑量組（100 mg·kg－1）能夠降低含量，升高SOD和GSH－Px水平，比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。結(jié)論綠原酸具有抗佐劑性關(guān)節(jié)炎（AA）的作用，并通過降低TNF－α、IL－2、CIC和MDA含量及提高抗氧化能力發(fā)揮作用。

綠原酸；佐劑性關(guān)節(jié)炎；血清腫瘤壞死因子；超氧化物歧化酶；谷胱甘肽過氧化物酶

綠原酸（CHA）是一種多酚類化合物，是由咖啡酸與奎尼酸形成的縮酚酸，存在于多種植物中，具有多種生物學(xué)活性［1］。本文對綠原酸抗佐劑性關(guān)節(jié)炎的作用進行實驗研究，為其臨床治療關(guān)節(jié)炎提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 藥物及主要試劑 綠原酸購自中國藥品生物制品檢定所，血清腫瘤壞死因子（TNF－α）、白細(xì)胞介素－2（IL－2）、循環(huán)免疫復(fù)合物（CIC）、超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH－Px）和丙二醛（MDA）試劑盒均購自北京鼎國生物技術(shù)有限責(zé)任公司。

1.1.2 實驗動物 SPF級SD雄性大鼠60只，體重（200±20）g，由北京華阜康生物科技股份有限公司提供，動物合格證號：SCSK（京）2010－0008。在符合清潔標(biāo)準(zhǔn)的實驗室（溫度：22～25℃，濕度：50%～70%）喂養(yǎng)。

1.1.3 儀器 電子數(shù)量卡尺（上海量具刀具廠）；722型光柵分光光度計（上海第三分析儀器出品）；全自動酶聯(lián)免疫分析儀（瑞士Tecan公司生產(chǎn)）。

1.2 方法

1.2.1 AA大鼠動物模型制備及分組體重（200± 20）g SD大鼠60只，隨機分為6組：空白對照組、模型組、陽性對照組（尼美舒利）、綠原酸低、中、高劑量組。按參考文獻方法［2，3］，取凍干卡介苗（BCG）1支（75mg）80℃1 h滅活后，混入滅菌石蠟油、羊毛脂（1∶1），乳化成Freund’s完全佐劑（含BCG 10 mg·mL－1）。除空白對照組，其他各組每鼠右后足跖注射Freund’s完全佐劑0.1 mL進行致炎，在致炎8～12 d后產(chǎn)生超敏反應(yīng)性炎癥，即繼發(fā)性免疫性關(guān)節(jié)炎形成。造模成功后，陽性對照組給予尼美舒利80 mg·kg－1，綠原酸低、中、高劑量組分別給予濃度25、50和100 mg·kg－1綠原酸，空白對照組和模型組給予等量生理鹽水，每天一次，連續(xù)灌胃15 d。

1.2.2 實驗指標(biāo)測定 分組并造模成功后用電子數(shù)量卡尺測量每組各鼠左、右足跖厚度，以此作為評價抗炎作用強度的基數(shù)，然后進行灌胃給藥。給藥后第14 d分別測量大鼠左、右后足跖厚度差值為腫脹度。眼球取血，分離血清，處死大鼠后摘取胸腺、脾臟稱重，并計算胸腺指數(shù)和脾臟指數(shù)；按照試劑盒說明書方法［4，5］測定血清TNF－α、IL－2、CIC、MDA的含量及SOD和GSH－Px活性的變化。

1.2.3 統(tǒng)計學(xué)分析 應(yīng)用SPSS 15.0統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)進行分析，計量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，P＜0.05表示有顯著性差異。

2 結(jié)果

與模型組比較，綠原酸組AA大鼠炎性足腫脹明顯，胸腺指數(shù)和脾臟指數(shù)明顯升高，其血清中TNF－α、IL－2、CIC、MDA的含量明顯降低（P＜0.05），同時，SOD和GSH－Px活性顯著升高（P＜0.05），結(jié)果見表1、2。

表1 綠原酸治療前后各組大鼠左、右足跖腫脹厚度（mm）（±s，n＝10）

表1 綠原酸治療前后各組大鼠左、右足跖腫脹厚度（mm）（±s，n＝10）

注：與模型組比較，*P＜0.05，與空白對照組比較，△P＜0.05

0.18±0.14 0.14±0.13模型組 0.97±0.26△ 1.19±0.32△陰性對照組 0.64±0.20* 0.55±0.21*綠原酸（低） 0.73±0.19 0.68±0.18綠原酸（中） 0.47±0.29* 0.39±0.18*綠原酸（高） 0.43±0.33* 0.40±0.21組別 左 右空白對照組*

表2 綠原酸對AA大鼠胸腺指數(shù)、脾臟指數(shù)、TNF－α、IL－2、CIC、MDA、SOD和GSH－Px的影響（±s，n＝10）

表2 綠原酸對AA大鼠胸腺指數(shù)、脾臟指數(shù)、TNF－α、IL－2、CIC、MDA、SOD和GSH－Px的影響（±s，n＝10）

注：與模型組比較，*P＜0.05，與空白對照組比較，△P＜0.05

組別 胸腺指數(shù) 脾臟指數(shù) TNF－α（pg·mL－1）IL－2（ng·mL－1） CIC（濁度值） MDA（nmol·mg－1）SOD（U·mg－1） GSH－Px（U·mg－1）6±1.2 1.68±0.46 129.38±22.62 55.23±11.12模型組 0.31±0.11△ 0.07±0.02△ 224.6±12.5△ 1.88±0.01△ 18.2±1.8△ 5.16±0.88△ 68.74±15.29△ 26.73±8.33△陽性對照組 0.57±0.02* 0.16±0.05* 186.2±15.4* 1.21±0.06* 10.5±2.3* 3.15±0.73* 98.44±23.52* 36.84±10.28*綠原酸（低） 0.42±0.03 0.11±0.03 201.7±21.6 1.65±0.12 15.7±2.4 4.96±0.83 78.69±19.97 48.05±7.90綠原酸（中） 0.55±0.04* 0.15±0.01* 169.3±17.8* 1.19±0.08* 9.6±1.5* 2.99±0.62* 117.38±19.25* 39.36±8.29*綠原酸（高） 0.58±0.12* 0.17±0.04* 160.9±22.5* 1.16±0.04* 9.3±2.7* 2.87±0.98* 118.14±13.79* 37.32±8.02空白對照組 0.68±0.09 0.18±0.01 144.2±18.2 1.08±0.02 8.*

3 結(jié)論

3.1 類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎（RA）是一種以關(guān)節(jié)滑膜炎為特征的慢性全身性自身免疫性疾病［6］，常伴關(guān)節(jié)腔滑膜組織炎癥、滲液、細(xì)胞增殖、肉芽形成以及軟骨、骨組織破壞等癥狀。早期表現(xiàn)為滑膜紅腫，關(guān)節(jié)明顯腫脹，多侵犯小關(guān)節(jié)如手、足和腕，常為對稱性［7］。完全弗氏佐劑誘導(dǎo)的AA大鼠模型在臨床表現(xiàn)、病理改變和血清學(xué)特點等方面與人類RA非常相似，是研究和篩選治療RA藥物常用的模型之一［8］。本研究結(jié)果表明，AA大鼠模型組關(guān)節(jié)腫脹明顯，綠原酸能夠顯著減輕AA大鼠足趾腫脹。

3.2 白細(xì)胞介素－2（IL－2）是體內(nèi)最強的T細(xì)胞生長因子，通過提高T細(xì)胞的數(shù)量和功能可增強機體的免疫功能，同時還可促進B細(xì)胞生長和分化，促進抗體的生成。TNF－α在RA發(fā)病和病程進展中起重要的作用，其拮抗劑或減少TNF－α的藥物對RA有顯著療效［9］。SOD是機體中主要的抗氧化酶之一，可以有效清除體內(nèi)過多的自由基。丙二醛（MDA）是脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物，在對過氧化物定量的實驗中常以MDA含量和水平為評價標(biāo)準(zhǔn)。GSH是細(xì)胞內(nèi)主要的氧化還原緩沖物質(zhì)，通過維持細(xì)胞內(nèi)的氧化還原平衡發(fā)揮清除ROS的作用。AA炎癥發(fā)生過程中自由基大量產(chǎn)生，清楚過多的自由基在抗炎過程中發(fā)揮的重要的作用［10］。

本文研究結(jié)果表明，綠原酸具有抗佐劑性關(guān)節(jié)炎（AA）并通過降低TNF－α、IL－2、CIC和MDA含量及提高抗氧化能力發(fā)揮作用。

［1］Park JB.Isolation and quantification ofmajor chlorogenic acids in threemajor instant coffee brands and their potential effects on H2O2－induced mitochondrial membrane depolarization and apoptosis in PC－12 cells［J］.Food Funct，2013，4（11）：1632－1638.

［2］岳莉，沈玉先，王華，等.重組人內(nèi)抑素對大鼠佐劑性關(guān)節(jié)炎繼發(fā)性炎癥的抑制作用［J］.中國藥理學(xué)通報，2003，19（8）：899－903.

［3］陶海英，黃華，侯桂萍，等.雪蓮注射液抗大鼠佐劑型關(guān)節(jié)炎和免疫調(diào)節(jié)作用［J］.中藥新藥與臨床藥理，2007，18（4）：269－273.

［4］王艾麗，武建國.微量比濁法檢測循環(huán)免疫復(fù)合物的實驗研究與應(yīng)用評價［J］.臨床檢驗雜志，1990，8（1）：30.

［5］Gao JM，LiR，Zhang L，etal.Cuscuta chinensis seedswater extraction protecting murine osteoblastic MC3T3－E1 cells against tertiary butyl hydroperoxide induced injury［J］.JEthnopharmacol，2013，148（2）：587－595.

［6］Mo J，Panichayupakaranant P，Kaewnopparat N，et al. Topical anti－inflammatory and analgesic activities of standardized pomegranate rind extract in comparison with its marker compound ellagic acid in vivo［J］.J Ethnopharmacol，2013，148（3）：901－908.

［7］牛拴成，張軒萍，楊彩紅，等.祛風(fēng)息痛丸對大鼠佐劑性關(guān)節(jié)炎的治療作用［J］.中國藥理學(xué)與毒理學(xué)雜志，2007，21（5）：422－426.

［8］Suke SG，Negi H，Mediratta PK，et al.Anti－arthritic and anti－inflammatory activity of combined pioglitazone and prednisolone on adjuvant－induced arthritis［J］.Eur J Pharmacol，2013，718（1－3）：57－62.

［9］Palomares RA，Brock KV，Walz PH.Differential expression of pro－inflammatory and anti－inflammatory cytokines during experimental infection with low or high virulence bovine viral diarrhea virus in beef calves［J］.Vet Immunol Immunopathol，2014，157（3－4）：149－154.

［10］Shi H，Dong L，Jiang J，et al.Chlorogenic acid reduces liver inflammation and fibrosis through inhibition of tolllike receptor 4 signaling pathway［J］.Toxicology，2013，303：107－114.

Anti－inflammatory effect of chlorogenic acid on adjuvant arthritis rats

XU Ying-hui1，SHEN Ru1，LIU Yan-yan2
（1.Huizhou Health Vocational College，Huizhou 516025，China；2.Tongren Polytechnic College，Tongren 554300，China）

ObjectiveTo investigate the effects of the anti－inflammatory effectof chlorogenic acid on adjuvantarthritis rats.MethodsTreated with various concentrations of chlorogenic acid on adjuvantarthritis（AA），then divided into six groups as control group，model group，positive control group（nimesulide），low dose（25 mg·kg－1），medium dose（50 mg· kg－1）and high dose（100 mg·kg－1）of chlorogenic acid to observe the effect of chlorogenic acid on adjuvant arthritis model rats with left and right foot plantar width，serum tumor necrosis factor（TNF－alpha），interleukin 2（IL－2），the amount of circulating immune complex（CIC），superoxide dismutase（SOD），glutathione peroxidase（GSH－Px）andmalondialdehyde（MDA）content.ResultsThe results demonstrated that chlorogenic acid（25 mg·kg－1and 100 mg·kg－1）can inhibit rat ear swelling caused by dimethylbenzene and foot swelling caused by freund′s adjuvant.Chlorogenic acid in medium dose group（50 mg·kg－1）and high dose group（100 mg·kg－1）could reduce the content of increase SOD and GSH－Px level，compare the differencewas statistically significant（P＜0.05）.ConclusionThe results demonstrated that chlorogenic acid had anti－inflammatory effect on adjuvant arthritis（AA）and by reducing the TNF－α，IL－2，CIC and MDA content and increasing antioxidant capacity.

Chlorogenic acid；Adjuvant arthritis；TNF－α；SOD；GSH－Px

R965

A

2095－5375（2014）09－0505－003

徐英輝，女，講師，研究方向：中藥成分分析及藥理研究，E－mail：asrblove＠126.com