參七蟲草膠囊對肺纖維化大鼠肺組織基質金屬蛋白酶－9及基質金屬蛋白酶抑制劑－1表達的影響

潘中良，張念志，呂園園，陳晶晶，魏姍姍，謝 勤

（1.安徽中醫藥大學研究生部，安徽合肥 230038；2.安徽中醫藥大學第一附屬醫院呼吸內科，安徽合肥 230031）

參七蟲草膠囊對肺纖維化大鼠肺組織基質金屬蛋白酶－9及基質金屬蛋白酶抑制劑－1表達的影響

潘中良1，張念志2，呂園園2，陳晶晶1，魏姍姍1，謝 勤1

（1.安徽中醫藥大學研究生部，安徽合肥 230038；2.安徽中醫藥大學第一附屬醫院呼吸內科，安徽合肥 230031）

目的 探究參七蟲草膠囊治療肺纖維化的機制。方法 將80只雄性SD大鼠隨機分成空白組、模型組、潑尼松組、參七蟲草膠囊組，每組20只。采用博萊霉素氣管內滴注法復制肺纖維化模型。給藥后15、30 d，分別觀察各組大鼠肺組織病理變化，并采用免疫組織化學方法檢測肺組織中基質金屬蛋白酶－9（matrix metalloproteinases－9，MMP－9）和基質金屬蛋白酶抑制劑－1（issue inhibitor of metalloproteinase－1，TIMP－1）的表達水平。結果 與模型組比較，參七蟲草膠囊組、潑尼松組大鼠各時點肺泡炎性反應和肺纖維化程度明顯減輕，各時點潑尼松組、參七蟲草膠囊組肺組織MMP－9、TIMP－1表達水平顯著降低（P＜0.05，或P＜0.01）。結論 參七蟲草膠囊抑制肺纖維化早期肺泡的炎性反應與其降低肺組織MMP－9、TIMP－1表達水平有關。

參七蟲草膠囊；肺纖維化；基質金屬蛋白酶；基質金屬蛋白酶抑制劑

肺纖維化是多種原因引起的彌慢性肺間質疾病共同的最終結局，也是肺組織自身修復的一種病理過程。近年來，在對肺間質纖維化的研究中，細胞外基質（extra cellular matrix，ECM）的變化越來越受到關注，其合成和降解失衡是引起肺纖維化的重要病理生理因素，基質金屬蛋白酶（matrixmetalloproteinases，MMPs）及基質金屬蛋白酶抑制劑（tissue inhibitor of metalloproteinases，TIMPs）是調節ECM降解的重要體系［1］。筆者旨在觀察參七蟲草膠囊對博來霉素致肺間質纖維化大鼠肺組織MMP－9、TIMP－1表達的影響，從而進一步探討參七蟲草膠囊防治肺纖維化的機制，現報告如下。

1 材料

1.1 實驗動物 雄性SD大鼠，體質量（200±20）g，共80只，由安徽醫科大學動物實驗中心提供，動物生產許可證號為SCXK（皖）2013－004。

1.2 實驗藥品及試劑 博萊霉素（bleocin，BLM）：每支150mg，日本化藥株式會社，批號230961；參七蟲草膠囊：安徽省中醫院呼吸科院內制劑，每粒0.4g，批號20110808；醋酸潑尼松片：浙江仙琚制藥股份有限公司生產，每片5mg，批號100102；MMP－9試劑盒：北京中杉公司，批號H4152；TIMP－1試劑盒：北京博奧森公司，批號9904228W。

2 方法

2.1 動物分組及模型復制方法 將80只SD大鼠隨機分為空白組、潑尼松組、模型組、參七蟲草膠囊組，每組20只。根據文獻［2］，先予10％水合氯醛3.5ml／kg麻醉大鼠，再經鼻一次性向氣管內滴注BLM 5.0mg／kg，滴注后立即將大鼠直立懸吊并前后旋轉，即可復制肺纖維化模型。

2.2 給藥方法 在模型復制24h后，治療組大鼠予以中劑量參七蟲草膠囊（每日0.35g／kg，相當于成人劑量7倍，溶于1ml蒸餾水中）灌胃，對照組大鼠給予潑尼松（每日6.0mg／kg，相當于成人劑量7倍，溶于1ml蒸餾水中）灌胃，模型組和空白組大鼠給予等容積生理鹽水灌胃，為期均30d。實驗期間，大鼠自由飲水和進食。

2.3 標本采集 給藥后15、30d，每組分別隨機取一半大鼠處死（在實驗過程中，共有16只大鼠死亡，原因不明），取肺組織，在生理鹽水中漂洗干凈，取右肺中葉置于10％甲醛中固定，經脫水、透明、浸蠟、包埋處理后制成石蠟組織塊和切片，采用免疫組織化學方法測定肺組織MMP－9、TIMP－1表達水平；行蘇木精－伊紅（hematoxylin eosin，HE）染色，觀察肺泡炎和肺纖維化程度。

2.4 標本檢測 ①采用光學顯微鏡觀察肺組織結構變化。②肺組織MMP－9和TIMP－1表達水平測定：采用免疫組織化學方法，按照MMP－9、TIMP－1試劑盒說明書檢測不同時點各組肺組織MMP－9、TIMP－1表達水平。以細胞中出現棕黃色顆粒為MMP－9和TIMP－1染色陽性反應，著色深表示表達水平越高。陽性表達部位主要集中在支氣管上皮細胞、Ⅱ型肺泡上皮細胞及中性

粒細胞。采用CIAS－1000型圖像分析儀分析切片，每張切片隨機采集5個視野（10×40倍），測量其MMP－9和TIMP染色陽性細胞的平均光密度，經過該系統自動分析獲得肺組織該視野的平均光密度值，取其平均值作為單個樣本的MMP－9、TIMP－1蛋白表達水平。

2.5 統計學方法 全部數據采用SPSS 17.0進行統計學分析。呈正態分布的連續型變量采用“均數±標準差（±s）”進行統計學描述，多組間均數比較采用單因素方差分析，兩組間均數比較采用LSD檢驗（方差齊）或Dunnett's T3檢驗（方差不齊）。P＜0.05為差異具有統計學意義。

3 結果

3.1 不同時點各組大鼠肺組織結構變化比較 空白組肺組織結構無破壞，肺泡腔內無炎性滲出。給藥后15d，模型組大鼠肺組織可見以巨噬細胞、淋巴細胞為主的大量炎性細胞浸潤，肺泡隔增寬，支氣管附近纖維化較明顯；參七蟲草膠囊組、潑尼松組肺內有少量炎性細胞浸潤，肺泡呈中度炎性反應及輕度纖維化改變。給藥后30d，模型組大鼠肺組織可見大片團塊狀巨噬細胞、淋巴細胞浸潤，肺組織結構破壞，肺泡腔縮小，肺間質被膠原纖維和成纖維細胞替代，肺間質纖維化形成；參七蟲草膠囊組、潑尼松組大鼠肺纖維化程度增加，但較模型組程度為輕。見圖1。

圖1 給藥后15、30d各組大鼠肺組織結構變化（HE染色，10×20倍）

3.2 不同時點各組大鼠肺組織MMP－9和TIMP－1表達水平比較 給藥后15、30d，與空白組比較，模型組大鼠肺組織MMP－9和TIMP－1表達水平均顯著升高（P＜0.01）；與模型組比較，潑尼松組和參七蟲草膠囊組大鼠肺組織MMP－9和TIMP－1表達水平均顯著降低（P＜0.05，或P＜0.01）；潑尼松組與參七蟲草膠囊組大鼠肺組織MMP－9和TIMP－1表達水平比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。見表1和圖2。

表1 不同時點各組大鼠肺組織MMP－9和TIMP－1表達水平比較（±s）

表1 不同時點各組大鼠肺組織MMP－9和TIMP－1表達水平比較（±s）

注：與同期空白組比較，＊＊P＜0.01；與同期模型組比較，＃P＜0.05，＃＃P＜0.01。

組 別nMMP－9／10－2 OD值TIMP－1／10－2 OD值30d空 白給藥后15d給藥后30d 給藥后15d給藥后8 0.42±0.06 0.40±0.04 0.39±0.06 0.40±0.04模 型8 0.60±0.07＊＊0.54±0.03＊＊0.59±0.08＊＊0.63±0.02＊＊潑尼松8 0.52±0.02＃＃0.48±0.04＃＃0.46±0.04＃＃0.52±0.01＃＃參七蟲草膠囊8 0.52±0.06＃＃0.51±0.03＃0.45±0.04＃＃0.50±0.03＃＃

4 討論

肺纖維化的形成是一個極其復雜的過程，雖然其病因或原發病有很大差異，但在纖維化過程中ECM代謝異常是類似的。ECM主要由膠原、彈力纖維、糖胺多糖等組成。成肌纖維細胞在ECM的合成、積聚和重構中起重要作用。ECM積聚異常增多是肺纖維化組織重構混亂的標志。纖維母細胞增生以及膠原等ECM成分過度沉積，肺泡正常的結構就會消失。肺泡炎程度愈重，肺損傷及纖維化愈重［3］。ECM的調節紊亂主要與MMPs及TIMP有關［4］，兩者之間的失衡可能是導致肺組織損傷、重塑和纖維化的重要機制之一［5］。MMPs是分解ECM的主要酶類。MMP－9是降解Ⅳ型膠原的主要酶。正常肺組織中僅有少量的MMP－9，但在肺纖維化產生過程中，成纖維細胞、支氣管上皮細胞、Ⅱ型肺泡上皮細胞等一些炎性細胞如巨噬細胞、中性粒細胞

都可產生MMP－9［6］。在疾病的不同時期，MMPs的表達是不同的，在肺纖維化早期肺組織以MMP－9的活性增強為主，主要存在于滲出的中性粒細胞、巨噬細胞和支氣管上皮細胞。這些炎性細胞釋放的MMP－9可使基底膜崩解、斷裂，致肺泡腔細支氣管化，而正是這種肺泡腔的細支氣管化，成纖維細胞的侵入和增殖，產生大量的ECM，導致肺纖維化的進一步形成。TIMPs是MMPs功能的重要調節因素，其作用主要是抑制MMPs對ECM的降解。TIMP－1在組織中特異性地抑制MMP－9，能抑制ECM的降解。正常狀況下，肺內ECM的合成和降解處于動態平衡，MMP－9／TIMP－1比值升高，肺損傷嚴重，以炎性反應為主；MMP－9／TIMP－1比值降低，肺組織以修復重塑為主。其比值的變化導致ECM的代謝失衡可能是肺纖維化形成的重要機制。因此研究MMP－9／TIMP－1的相互作用關系對肺纖維化的發病機制和治療有實際應用價值。

圖2 給藥后不同時點各組大鼠肺組織MMP－9和TIMP－1表達水平比較（紅色箭頭示免疫組織化學染色陽性細胞，10×40倍）

既往研究［7］已證實冬蟲夏草具有抑制和預防肺纖維化發生的作用。目前活血化瘀法是已被認可的治療肺纖維化的常用療法。參七蟲草膠囊是張念志治療肺間質纖維化的經驗方，由西洋參、三七、冬蟲夏草3味藥物按照1∶1∶1的配伍比例組成，具有益氣養陰、活血化瘀、益肺固腎的作用。方中西洋參為君藥，輔以冬蟲夏草益肺腎之精，佐以三七活血化瘀以治標。諸藥合用，配伍合理，標本同治，補虛不留邪，祛邪不傷正。實驗研究［8］發現，參七蟲草膠囊能降低肺纖維化大鼠轉化生長因子－β1mRNA的表達水平，能減輕肺纖維化的程度。

本研究結果表明，模型組大鼠各時點肺組織MMP－9、TIMP－1表達水平顯著高于同時點空白組，提示MMP－9、TIMP－1參與了肺纖維化的發展。此外，各組MMP－9表達水平在給藥后30d較給藥后15d呈下降趨勢，說明MMPs活性與肺泡免疫反應密切相關。而各組TIMP－1表達水平在給藥后30d達到最高值，提示TIMP－1表達水平持續升高可能亦與肺纖維化的形成有密切關系。因為在肺纖維化的早期主要是以肺損傷、肺泡炎癥為主要病理特征，后期炎性細胞減少，纖維化程度增強，所以在肺纖維化早期和中期MMP－9、TIMP－1均呈高表達狀態，這可能是炎癥早期未出現ECM積聚的重要原因之一。而到肺纖維化晚期，隨著MMP－9表達水平降

低，TIMP－1表達水平仍持續升高，同時抑制了MMP－9的活性，可能會使MMP－9／TIMP－1比值變小，平衡漸向TIMP－1傾斜，使基質膠原酶活性下降，膠原沉積，導致肺組織中出現一個降解低下的微環境，ECM的降解減少而合成增加，導致膠原等ECM過度沉積，從而形成肺纖維化。參七蟲草膠囊組各時點肺組織MMP－9、TIMP－1表達水平均顯著低于模型組，提示參七蟲草膠囊在實驗早期可以降低MMP－9的表達，從而減輕ECM對基底膜的損傷，在肺纖維化后期抑制肺內TIMP－1表達，從而減少TIMP－1對MMP－9表達的抑制，促進MMP－9對ECM的降解，使MMP－9／TIMP－1系統趨于平衡，從而延緩肺纖維化的發生與發展。參七蟲草膠囊組與潑尼松組MMP－9和TIMP－1水平比較，差異均無統計學意義，提示參七蟲草膠囊具有糖皮質激素樣抑制肺間質纖維化的作用。

綜上所述，參七蟲草膠囊能夠抑制肺纖維化大鼠肺組織的炎癥及病理變化，其作用與抑制肺組織中MMP－9與TIMP－1表達水平有關。

［1］丁明橋，許朝霞.銀杏葉提取物對肺纖維化大鼠模型肺組織MMP－9及TIMP－1表達的影響［J］.北京中醫藥，2011，30（11）：869－871.

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Effects of Shenqichongcao Capsule on Expression of Matrix Metalloproteinase－9 and Tissue Inhibitor of Metalloproteinase－1in Lung Tissues of Rats with Pulmonary Fibrosis

PAN Zhong－liang1，ZHANG Nian－zhi2，LüYuan－yuan1，CHEN Jing－jing1，WEI Shanshan1，XIE Qin1
（1.Graduate Division，Anhui University of Chinese Medicine，Anhui Hefei 230038，China；2.Department of Respiratory Medicine，The First Affiliated Hospital of Anhui University of Chinese Medicine，Anhui Hefei 230031，China）

Objective To investigate the action mechanism of Shenqichongcao Capsule in the treatment of pulmonary fibrosis.Methods Eighty male Sprague－Dawley rats were randomly and equally divided into blank group，model group，prednisone group，and Shenqichongcao Capsule group.In the model group，prednisone group，and Shenqichongcao Capsule group，a rat model of pulmonary fibrosis was induced by intratracheal instillation of bleomycin.Then，the prednisone group and Shenqichongcao Capsule group received prednisone and Shenqichongcao Capsule，respectively，and the blank group and model group received an equal volume of normal saline.On days 15and 30of treatment，the pathological changes of lung tissues were evaluated，and the expression of matrix metalloproteinase－9（MMP－9）and tissue inhibitor of metalloproteinase－1（TIMP－1）in lung tissues was measured by immunohistochemistry.Results Compared with the model group，the Shenqichongcao Capsule group and prednisone group had significantly reduced alveolar inflammation and pulmonary fibrosis and significantly decreased expression of MMP－9and TIMP－1in lung tissues at all time points（P＜0.05or P＜0.01）.Conclusion Shenqichongcao Capsule can inhibit the alveolar inflammation in the early stage of pulmonary fibrosis，possibly by decreasing the expression of MMP－9and TIMP－1in lung tissues.

Shenqichongcao Capsule；pulmonary fibrosis；matrix metalloproteinase；tissue inhibitor of metalloproteinase

R563；R285.5

A

10.3969／j.issn.2095－7246.2014.02.025

2013－12－17）

潘中良（1984－），男，碩士研究生，醫師

張念志，zhangnianzhi6809＠sohu.com