利多卡因?qū)Ψ稳毖俟嘧p傷模型大鼠炎癥反應(yīng)因子的影響

倪程耀，陳 新，吳勝軍（浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院，杭州 310003）

肺缺血再灌注損傷（Lung ischemia reperfusion injury，LIRI）常發(fā)生在體外循環(huán)手術(shù)、肺移植、肺栓塞治療恢復(fù)血液供應(yīng)后，是在缺血的基礎(chǔ)上機(jī)體繼發(fā)的再灌注損傷，會導(dǎo)致患者臨床癥狀不減輕反而加重的病理狀態(tài)，是危害患者恢復(fù)健康的重要障礙[1]。隨著人們對LIRI發(fā)病機(jī)制的深入研究，已應(yīng)用多種藥物治療LIRI，并取得了良好的效果。利多卡因作為一種膜穩(wěn)定劑，廣泛地應(yīng)用于多種疾病的治療，現(xiàn)研究認(rèn)為其能保護(hù)肺泡上皮細(xì)胞的功能，可減輕肺損傷[2]。因此本研究應(yīng)用大鼠建立LIRI模型，體外給予利多卡因干預(yù)，觀察其對LIRI的保護(hù)作用。

1 材料

1.1 儀器

DH-150型動物呼吸機(jī)（浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)儀器廠）。

1.2 藥品與試劑

利多卡因注射液（江蘇濟(jì)川制藥有限公司，批號：080531，規(guī)格：40 mg ∶5 ml）；苯巴比妥鈉注射液（廣東邦民制藥有限公司，批號：041042，規(guī)格：100 mg ∶1 ml）；腫瘤壞死因子α（TNF-α）、白細(xì)胞介素（IL）-1、IL-6和IL-8檢測試劑盒（美國eBioscience公司）。

1.3 動物

2 方法

2.1 建模

大鼠經(jīng)耳緣靜脈注射30 mg/kg的苯巴比妥鈉麻醉，氣管切開后插管，接動物呼吸機(jī)控制呼吸，呼吸頻率60次/min，潮氣量單側(cè)肺通氣8～10 ml/kg，雙側(cè)肺通氣15～20 ml/kg，呼吸比1 ∶2。然后經(jīng)胸骨右緣第3～5肋間開胸，離斷周圍組織，游離左肺門，呼氣末時(shí)結(jié)扎右肺門，60 min后開放行再灌注，制成LIRI模型。

2.2 分組與給藥

取90只大鼠隨機(jī)均分為假手術(shù)組、模型組和預(yù)處理組，每組30只。模型組大鼠行左肺缺血再灌注，即開胸游離左肺門后，阻斷左肺門60 min，而后松開血管夾形成再灌注；假手術(shù)組大鼠只開胸而不行左肺缺血再灌注；預(yù)處理組大鼠術(shù)前15 min注射利多卡因1.2 mg/kg，并以1 mg/（kg·h）維持30 min，阻斷左肺門60 min，而后松開血管夾形成再灌注。

2.3 標(biāo)本采集與指標(biāo)檢測

各組大鼠于缺血30 min和再灌注60、120 min時(shí)采集標(biāo)本。采集大鼠支氣管肺泡灌洗液，采用考馬斯亮藍(lán)染色法對其蛋白總量（TP）進(jìn)行測定；收集支氣管肺泡灌洗液沉渣，計(jì)數(shù)白細(xì)胞（WBC）數(shù)量，并采用瑞氏染色進(jìn)行白細(xì)胞分類，計(jì)算中性粒細(xì)胞（PMN）比例；取一定的肺組織，應(yīng)用天平稱量其濕質(zhì)量（W），置于70 ℃烤箱烘烤48 h后，測量其干質(zhì)量（D），計(jì)算肺組織的濕/干質(zhì)量（W/D）比值；取肺組織配制成10%的組織勻漿，采用酶聯(lián)免疫吸附雙抗體夾心法（ELISA）檢測肺組織勻漿中TNF-α、IL-1、IL-6、IL-8含量，操作步驟嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行。

2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

3 結(jié)果

3.1 TP、WBC數(shù)量、PMN比例、W/D比值結(jié)果

與假手術(shù)組比較，模型組大鼠再灌注60、120 min時(shí)和預(yù)處理組再灌注120 min時(shí)TP、WBC數(shù)量、PMN比例、W/D比值均明顯升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；與模型組比較，預(yù)處理組大鼠再灌注60、120 min時(shí)TP、WBC數(shù)量、PMN比例、W/D比值均明顯降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。各組大鼠肺泡灌洗液中TP、WBC數(shù)量、PMN比例和W/D比值比較見表1。

表1 各組大鼠肺泡灌洗液中TP、WBC數(shù)量、PMN比例和W/D比值比較（，n＝10）Tab 1 Comparison of TP，WBC，PMN proportion andW/D in bronchoalveolar lavage fluid in each group rats（，n＝10）

表1 各組大鼠肺泡灌洗液中TP、WBC數(shù)量、PMN比例和W/D比值比較（，n＝10）Tab 1 Comparison of TP，WBC，PMN proportion andW/D in bronchoalveolar lavage fluid in each group rats（，n＝10）

與假手術(shù)組比較：＊P＜0.05；與模型組比較：#P＜0.05vs.sham operation group：＊P＜0.05；vs.model group：#P＜0.05

3.2 TNF-α、IL-1、IL-6及IL-8含量結(jié)果

與假手術(shù)組比較，模型組大鼠再灌注60、120 min時(shí)和預(yù)處理組再灌注120 min時(shí)肺組織勻漿中TNF-α、IL-1、IL-6及IL-8含量均明顯升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；與模型組比較，預(yù)處理組大鼠再灌注60、120 min時(shí)肺組織勻漿中TNF-α、IL-1、IL-6及IL-8含量均明顯降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。各組大鼠肺組織勻漿中TNF-α、IL-1、IL-6及IL-8含量比較見表2。

表2 各組大鼠肺組織勻漿中TNF-α、IL-1、IL-6及IL-8含量比較（，pg/ml，n＝10）Tab 2 Comparison of the contents of TNF-α，IL-1，IL-6 and IL-8 in lung tissue homogenate in each group rats（，pg/ml，n＝10）

表2 各組大鼠肺組織勻漿中TNF-α、IL-1、IL-6及IL-8含量比較（，pg/ml，n＝10）Tab 2 Comparison of the contents of TNF-α，IL-1，IL-6 and IL-8 in lung tissue homogenate in each group rats（，pg/ml，n＝10）

與假手術(shù)組比較：＊P＜0.05；與模型組比較：#P＜0.05vs.sham operation group：＊P＜0.05；vs.model group：#P＜0.05

4 討論

近年來，由于LIRI的存在使應(yīng)用心肺置換術(shù)、心肺轉(zhuǎn)流術(shù)等的心肺疾病晚期患者臨床癥狀加重，成為術(shù)后恢復(fù)健康的重要障礙。有報(bào)道稱，肺移植術(shù)后因LIRI導(dǎo)致的死亡率高達(dá)16%～25%，嚴(yán)重影響了患者的生命健康，是臨床亟需解決的問題[3]。有關(guān)LIRI的發(fā)病機(jī)制至今不明，但多數(shù)研究認(rèn)為其與以下因素有關(guān)：氧自由基的釋放、脂質(zhì)過氧化反應(yīng)、鈣穩(wěn)態(tài)的失衡、炎性物質(zhì)的浸潤、免疫因素的干擾及細(xì)胞凋亡[4]。其中，免疫因素的干擾占有舉足輕重的地位。

免疫因素可通過以下途徑參與到LIRI的發(fā)病機(jī)制中：（1）炎性細(xì)胞因子與相應(yīng)受體結(jié)合，激活溶酶體使其溶解消化肺組織；（2）刺激血管內(nèi)皮細(xì)胞分泌黏附分子，增加WBC的黏附作用及聚集作用；（3）刺激巨噬細(xì)胞分泌趨化性因子，加重炎癥反應(yīng)，可使PMN大量聚集，導(dǎo)致細(xì)胞壞死，釋放過氧化物和溶酶體酶等，加劇免疫反應(yīng)，從而導(dǎo)致肺組織損傷[5-7]。已有研究表明，在LIRI后的肺泡灌洗液中，TNF-α、IL-1、IL-6及IL-8含量顯著高于血漿中水平，提示了免疫反應(yīng)在LIRI方面的重要性[8]。從本研究可以看出，模型組大鼠W/D比值及肺泡灌洗液中WBC數(shù)量、PMN比例及TP明顯高于假手術(shù)組（P＜0.05），說明在再灌注中確實(shí)存在肺組織損傷及WBC與PMN的聚集。隨著再灌注時(shí)間的推移，損傷及聚集作用隨疾病進(jìn)展逐漸加劇。模型組大鼠中再灌注60、120 min時(shí)肺組織勻漿中TNF-α、IL-1、IL-6、IL-8含量明顯高于假手術(shù)組（P＜0.05），驗(yàn)證了炎性細(xì)胞因子參與了LIRI的發(fā)病機(jī)制，并且肺組織勻漿炎性因子含量隨疾病的進(jìn)程相應(yīng)增加，說明炎性因子隨疾病進(jìn)展存在著相對應(yīng)的變化。這一研究結(jié)果與國內(nèi)相關(guān)研究[9-10]基本吻合，均提示免疫因素在LIRI疾病中起著重要作用。

隨著人們對LIRI發(fā)病機(jī)制研究的逐步深入，可應(yīng)用多種內(nèi)、外源性的化學(xué)物質(zhì)對LIRI進(jìn)行治療，從而達(dá)到保護(hù)肺的作用。其治療藥物根據(jù)不同的機(jī)制可分為以下幾類：（1）抗氧化劑或抗氧化酶，如膽紅素、黃酮類、氨溴索；（2）抑制細(xì)胞核因子κB（NF-κB）信號通路因子，如抗炎性因子、山莨菪堿、前列腺素E1等；（3）通過信號分子途徑，如吸入一氧化氮及一氧化碳、烏司他丁、黃酮化合物等；（4）炎癥因子和細(xì)胞黏附因子，如鹽酸氨溴索、糖皮質(zhì)激素、分泌型白細(xì)胞蛋白酶抑制劑、羅格列酮等[11]。其中，利多卡因被認(rèn)為是膜穩(wěn)定劑，可抑制中性粒細(xì)胞的炎性反應(yīng)，通過多種途徑來減輕LIRI并加大肺損傷的修復(fù)，其機(jī)制可歸納為以下幾點(diǎn)：（1）穩(wěn)定細(xì)胞膜，抑制炎性反應(yīng)的各個(gè)環(huán)節(jié)；（2）促進(jìn)肺泡上皮細(xì)胞生長，抑制肺泡上皮細(xì)胞凋亡[12]。從本研究結(jié)果可以看出，應(yīng)用利多卡因一段時(shí)間后，大鼠W/D比值及肺泡灌洗液中WBC數(shù)量、PMN比例及TP明顯低于模型組（P＜0.05），肺組織勻漿TNF-α、IL-1、IL-6、IL-8含量也明顯低于模型組（P＜0.05），提示利多卡因可通過抑制炎癥反應(yīng)來減緩LIRI，從而改善肺組織損傷，符合國內(nèi)外對利多卡因作用機(jī)制的研究。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)建立在針對大鼠的LIRI模型上，在不同時(shí)間點(diǎn)上動態(tài)觀察了免疫相關(guān)指標(biāo)在疾病進(jìn)程中的變化，并體外給予利多卡因，觀察了免疫相關(guān)指標(biāo)的變化。LIRI的主要病理改變?yōu)榉谓M織內(nèi)皮的廣泛破壞、肺毛細(xì)血管通透性的增加，從而導(dǎo)致肺泡和間質(zhì)的水腫和損傷。其機(jī)制復(fù)雜，早期給予干預(yù)措施，可大大提高治愈率和預(yù)后恢復(fù)。本研究結(jié)果顯示，免疫因素尤其是炎性細(xì)胞因子在LIRI的疾病進(jìn)展中發(fā)揮了重要作用，利多卡因可通過抑制炎性反應(yīng)來改善肺組織的損傷。本實(shí)驗(yàn)從炎性反應(yīng)因子這一角度探討了利多卡因改善LIRI的機(jī)制，為臨床應(yīng)用該藥提供了理論依據(jù)，但其臨床具體應(yīng)用仍需進(jìn)一步研究。

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