流動注射化學發光法測定人尿液中尿酸的含量Δ

齊慧麗，蓋 軻，馬東平（隴東學院化學化工學院，甘肅慶陽 745000）

在動物體內，尿酸（Uric acid，UA）是嘌呤堿的氧化產物，嘌呤代謝紊亂可以導致痛風、高尿血癥、Lesch-Nyhan綜合征，而腎臟損傷、白血病或肺炎患者則常會出現高尿血癥，白血病患者24 h UA最大排泄量可達12 g，而正常人只有250～750 mg[1]。由此可見，進行生理體液中UA的測定，對診斷和治療由嘌呤代謝紊亂引起的上述疾病及選擇正確的藥物治療處方，具有重要的指導作用。現行的臨床檢驗方法中，測定UA最常用的是磷鎢酸還原法[2]，但體液中存在的還原性物質和有色物質對比色法有干擾，同時，體液中的蛋白能與UA血漿形成共沉淀，導致有色溶液的渾濁，給檢測帶來困難；采用高效液相色譜法[3-5]可提高檢測的選擇性，但這些方法涉及昂貴的儀器或復雜的裝柱過程、蛋白質的分離過程，造成了檢測操作上的不便；利用酶促反應的特異性，也可以提高選擇性[6-7]，但酶試劑昂貴，穩定性較差，且酶分析法操作復雜；直接電化學方法具有快速、簡便和靈敏度高等優點，但由于UA和抗壞血酸（AA）在人體液中同時存在，且具有類似的氧化峰電位，用裸電極檢測時易受干擾。目前，許多化學修飾電極用于AA共存體系中UA的測定取得了較好的效果[8-10]，但由于臨床需要，仍需對簡便、高靈敏度和高選擇性的方法進行研究。化學發光法具有儀器簡單、靈敏度高、線形范圍寬的優點，但將化學發光法用于UA測定的報道并不多見[11-12]。在試驗中，筆者發現，熒光素、溴化十六烷基三甲銨（CTMAB）、銅離子（Cu2+）的混合物與可以發生化學發光反應，UA則是該化學發光反應的猝滅劑。AA基于這一現象，結合流動注射技術，建立了測定人尿液中UA含量的方法，對此猝滅現象的特性進行了研究。

1 材料

1.1 儀器

BPCL超微弱發光分析儀（中國科學院生物物理研究所）；F-7000熒光分光光度計（日本日立公司）；pHS-3C型數字酸度計（上海精密科學儀器有限公司）。

1.2 藥品與試劑

UA標準品（美國Sigma公司，含量＞99.6%，批號：050K08822）；銅粉（天津市致遠化學試劑有限公司）；硝酸（HNO3，天津市科密歐化學試劑有限公司）；氫氧化鈉（NaOH，天津百世化工有限公司）；CTMAB（北京奧博星生物技術責任有限公司）；熒光素（上海試劑三廠）；AA（成都市科龍化工試劑廠）；試驗所用試劑均為分析純，水為二次蒸餾水。

2 方法與結果

2.1 溶液的配制

2.1.1 UA標準溶液。稱取UA標準品0.200 0 g溶于1 L水中，作為貯備液（200 mg/L）。0.1～20 mg/L的UA標準溶液則由貯備液稀釋而成，且保證其中AA的含量為25 mg/L。

2.1.2 Cu2+貯備液（1.0×10－2mol/L）。稱取銅粉0.635 0 g，用1∶1 HNO3溶解，定容至1 L。

2.1.3 熒光素標準溶液（5.0×10－3mol/L）。稱取熒光素1.662 0 g，用0.1 mol/L NaOH 10 ml溶解，定容至1 L。

2.1.4 混合化學發光試劑的配制。依次向1 L量瓶中加入5.0×10－2mol/L CTMAB100 ml和Cu2+貯備液10 ml，最后邊振搖邊緩慢加入5.0×10－3mol/L熒光素標準溶液100 ml，配制成混合化學發光試劑。

2.2 試驗方法

流動注射化學發光法測定UA的流路如圖1所示。蠕動泵P1用來輸送混合化學發光試劑和NaOH，蠕動泵P2用來輸送載液（水）和樣品。兩個泵的流速均為2.5 ml/min。管路的連接均采用0.8 mm內徑的聚四氟乙烯（PTFE）管，采樣環體積30 μl。將混合化學發光試劑與NaOH溶液混合后，由水載流再與UA標準溶液（或UA樣品）混合，UA標準溶液系列和UA樣品中均加入AA，保證其中AA濃度為25 mg/L。以水作空白得到發光強度I0；待空白穩定后將UA溶液注入，測定其發光強度Is。光電倍增管的工作電壓為－800 V。化學發光信號值由BPCL超微弱發光分析儀檢測、記錄。以ΔI＝I0－Is與質量濃度c的線性關系進行定量。

圖1 流動注射化學發光法測定UA的流路示意圖a.樣品；b.載液；c.混合化學發光試劑；d.NaOH溶液；P1、P2.蠕動泵；V.進樣閥；CL cell.化學發光池；PMT.光電倍增管Fig 1 Schematic diagram of uric acid determined by flow injection chemiluminescencea.sample；b.carrier liquid；c.mixed chemiluminescence reagent；d.NaOH；P1，P2.peristaltic pump；V.admission valve；CL cell.chemiluminescence cell；PMT.photomultiplier

2.3 試驗條件的優化

本方法測定UA是基于UA能猝滅熒光素混合化學發光體系與AA的化學發光。因此，筆者詳細研究了影響熒光素混合化學發光體系與AA反應的因素。

2.3.1 反應介質濃度的選擇。該化學發光反應必須在堿性條件下進行，試驗中分別采用相同濃度的NaOH、碳酸氫鈉、碳酸鈉、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉和NaOH-碳酸鈉作為反應介質考察對信號強度的影響。結果表明，用NaOH溶液稀釋魯米諾（3-氨基鄰苯二甲酰肼）溶液，不僅可以增強測定體系的化學發光信號，還可提高化學發光信號的重現性。因此，試驗中選擇NaOH溶液作為反應介質。

試驗中考察了NaOH濃度對化學發光強度的影響，見圖2。在1.0×10－2～0.25 mol/L范圍內，ΔI隨NaOH濃度的增大而增大；NaOH濃度為0.25 mol/L時，ΔI達最大值；在0.25～0.5 mol/L范圍內，ΔI隨NaOH濃度的增大反而減小。因此，試驗中選擇0.25 mol/LNaOH作為最佳濃度。

圖2 NaOH濃度對ΔI的影響Fig 2 Effects of NaOH concentration on ΔI

2.3.2 熒光素濃度的選擇。熒光素濃度與測量的靈敏度和重現性直接相關。筆者考察了熒光素濃度在1.0×10－4～2.5×10－3mol/L范圍內對化學發光強度的影響，見圖3。熒光素濃度在1.0×10－4～5.0×10－4mol/L范圍內，隨著熒光素濃度的增大，ΔI值增大；當熒光素濃度增大至5.0×10－4mol/L時，ΔI達最大值；進一步增大熒光素的濃度，ΔI值反而降低。因此，在試驗中選用5.0×10－4mol/L的熒光素。

圖3 熒光素濃度對ΔI的影響Fig 3 Effects of fluorescein concentration on ΔI

2.3.3 表面活性劑濃度的選擇。表面活性劑CTMAB可以增敏AA和混合化學發光試劑的發光強度。筆者考察了CTMAB濃度在0～1.0×10－2mol/L范圍內對體系化學發光強度的影響，見圖4。無CTMAB時，體系的化學發光強度非常弱；CTMAB的濃度在5.0×10－4～5.0×10－3mol/L范圍內，ΔI值隨著CTMAB的濃度增大而增大；當CTMAB濃度超過5.0×10－3mol/L時，ΔI值不再明顯增大。因此，試驗選用濃度為5.0×10－3mol/L的CTMAB作為增敏劑。

圖4 CTMAB濃度對ΔI的影響Fig 4 Effects of CTMAB concentration on ΔI

2.4 含量測定方法學考察

2.4.1 線性關系與檢出限考察。通過試驗研究，確定測定體系的反應試劑濃度分別為：NaOH溶液0.5 mol/L、熒光素5.0×10－4mol/L、銅離子1.0×10－4mol/L、CTMAB 5.0×10－3mol/L、AA 25 mg/L，主泵（P1）、副泵（P2）流速均為2.5 ml/min，光電倍增管負高壓為800 V。在上述優化的試驗條件下，對一系列濃度的UA溶液進行測定。以水作空白測得發光強度I0；待空白穩定后將濃度分別為0.1、0.5、1.0、2.5、5.0、10、15、20 mg/L的UA溶液注入，測定其發光強度Is。以ΔI＝I0－Is與質量濃度c的線性關系進行定量。結果線性回歸方程為：ΔI＝－306.58c+3 557.9（r＝0.999 0，n＝5），表明在0.1～20 mg/L質量濃度范圍內，相對化學發光強度變化值（ΔI）與UA的質量濃度（c）呈良好的線性關系，檢出限為3.3×10－2mg/L。

2.4.2 精密度試驗。配制1 mg/L的UA標準溶液，在優化的試驗條件下，對1 mg/L的UA進行11次平行測定，得相對標準偏差（RSD）為1.2%，表明方法精密度良好。

2.4.3 加樣回收率試驗。取3份已知含量的樣品，分別加入等量UA溶液，按“2.2”項方法操作，測定UA的含量，計算加樣回收率。結果3份樣品的加樣回收率分別為101.0%、99.5%、98.4%，平均加樣回收率為99.63%；RSD分別為0.57%、0.81%、1.40%，總平均值為0.93%（n＝3）。結果表明該方法準確可靠，見表1。

表1 加樣回收率試驗結果（n＝3）Tab 1 Results of recovery tests（n＝3）

2.4.4 干擾試驗。為了考察該體系測定UA的選擇性，配制合成尿樣作為干擾物。合成尿樣含有尿液中除UA以外的大部分物質，見表2。其中，每種物質的量都按成人24 h最高排泄量計，而成人24 h排尿量按1 L計[1]。將含有1 mg/L UA的合成尿樣與1 mg/L的標準UA溶液分別進樣，所得信號值差異＜5%。結果表明，正常量的共存物質并不干擾UA的測定，2倍量的共存物質有5%的正干擾。

表2 合成尿樣的成分Tab 2 The composition of the urine sample

2.5 樣品分析

分別取3名志愿者的新鮮尿液，稀釋后按“2.2”項方法進行化學發光法測定，同時將樣品送檢醫院實驗室檢查（采用UA酶-過氧化物酶偶聯法[2]測定樣品中UA的含量）。測定結果表明，本方法對尿樣中UA含量的測定結果與醫院實驗室檢查的結果一致，見表3。

表3 尿樣分析結果Tab 3 Results of the urine sample analysis

3 討論

3.1 流路的選擇

流路中各管道加入的反應試劑不同將影響反應的進程。前期試驗中試驗了3種不同流路對化學發光強度的影響，結果選擇a、b、c、d 4個管道分別加入UA標準溶液、水、混合化學發光試劑和NaOH溶液時，該流路發光信號比較穩定且ΔI值較大。

3.2 混合化學發光試劑穩定時間

通過試驗發現，該體系的發光強度與混合化學發光試劑的穩定時間有關。在5 d時間內，放置時間越長，試劑與AA所產生的化學發光強度越大。穩定期超過5 d，化學發光強度在3個月內趨于穩定。故本試驗所使用的發光混合試劑均放置5 d以上。

3.3 AA用量的選擇

試驗研究表明，樣品或UA標準溶液中AA質量濃度越低，測定UA的檢出限就越低。為了獲得足夠低的檢出限、更好的重現性和足夠寬的線性范圍，且考慮到尿液中含有20～30 mg/L的AA（成人）[1]，筆者考察了10～60 mg/L的AA對UA測定的影響。試驗結果表明，當加入的AA質量濃度為25 mg/L時ΔI值達最大值，同時可得到足夠低的檢出限和足夠好的重現性。因此試驗選用質量濃度為25 mg/L的AA。

本研究建立了化學發光法測定人尿液中UA含量的新方法，該方法無需對樣品進行分離，可直接檢測；尿液無需特殊處理，直接稀釋后，其中的UA可以選擇性地猝滅AA與熒光素-表面活性劑-銅離子混合物在堿性條件下產生的化學發光。本方法采用化學發光結合流動注射技術測定人尿液中UA含量，分析結果與醫院實驗室的檢查結果具有很好的一致性。本法分析系統設備簡單，操作簡便，結果可靠，能對尿液中UA含量進行快速測定，可用于監測由于代謝紊亂和使用藥物所引起的UA異常，為臨床診斷和處方提供依據。

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