幾種常見保存方法對浮游動物生物量的影響*

馮秋園 孫曉霞 任琳琳

(1.中國科學院海洋研究所 山東膠州灣海洋生態系統國家野外科學觀測研究站 青島 266071;2.中國科學院大學 北京 100049)

浮游動物是海洋生態系統的重要組成部分,是海洋生物生產過程的核心之一,是調節海洋生態系統物質流和能量流的關鍵環節,是諸多國際研究計劃的重要內容(孫曉霞,2011)。生物量的估算是研究浮游動物現存量和生產力的中心環節(Gaston,1996)。目前國際上對于浮游動物的研究常基于豐度這一概念,但是由于不同種類的浮游動物之間存在較大的差異,即使是同一類群的浮游動物,體型大小不同其生物量也存在差異,僅僅基于浮游動物的豐度難以實際地反映出浮游動物在生態系統中的地位和作用,因此,對浮游動物生物量的估算是海洋生態學研究的重要內容。5%的甲醛,-20°C冰凍以及液氮是幾種常用的浮游動物保存方法。由于不同的保存方法會引起浮游動物生物量不同程度的變化,了解不同保存方法對浮游動物生物量的影響對于提高浮游動物生物量的估算精度非常關鍵。國際上針對福爾馬林保存對浮游動物生物量的影響開展了一系列研究(Donaldet al,1977;Gastonet al,1996;Leuvenet al,1985;Dumontet al,1975;Kuhlmannet al,1982;Ajahet al,2003;Williamset al,1982;Giguereet al,1989),但是對液氮和冰凍保存對浮游動物樣品所產生的影響研究較少,國內對這方面的研究則更為有限。由于生物量的損失程度與浮游動物的種類、保存方法和保存時間等具有很大的關系(Donaldet al,1977;Morris,1972),針對中國近海浮游動物優勢種類,研究中國近海浮游動物生物量在不同保存條件下的變化規律對于估算中國近海浮游動物生物量非常必要。

中華哲水蚤(Calanus sinicus)和強壯箭蟲(Sagitta crassa)是黃東海海域的浮游動物優勢種(楊波等,1988;陳亞瞿等,1980),且在膠州灣全年都有分布(孫松等,2008)。在黃海海區,中華哲水蚤生物量較高,在5月生物量高達55.5mg/m3,占總生物量的29.6%(楊波等,1988)。春季,在東海赤潮高發區,中華哲水蚤作為餌料生物,優勢度達 0.68,處于絕對優勢地位(徐兆禮等,2003)。在膠州灣,強壯箭蟲在數量上占有優勢,年平均密度達45.3ind/m3(王倩等,2010)。濕重(WW)、干重(WD)和碳(C)、氮(N)含量是生物量的重要參數。本文以中華哲水蚤和強壯箭蟲為研究對象,以濕重、干重和C、N含量為生物量參數,研究了上述幾種保存方法對浮游動物生物量的影響,為直接測量生物量或通過體型-生物量方程間接估計生物量提供校正因子。在上述研究的基礎上,利用體型-生物量間接估算法,結合圖像自動識別技術,可以快速自動得到不同種類的浮游動物在較大時空范圍內的生物量,為認識海洋食物網各營養級之間的物質循環和能量流動奠定基礎。

1 材料和方法

1.1 樣品采集

2012年3月在膠州灣進行采樣,采樣站位見圖1,A1-D7表示在膠州灣進行常規監測的采樣點位置,由于C3和D7站浮游動物的數量相對較大,因此本實驗所用的浮游動物樣品主要采于C3和D7兩站。使用浮游生物淺水I型網(網口直徑50cm,網長145cm,網孔 500μm)由底到表垂直拖網采集,采到的鮮活樣品置于冰桶中帶回實驗室處理。

圖1 膠州灣采樣站點Fig.1 Sampling stations in the Jiaozhou Bay,the Yellow Sea

1.2 實驗方法

本實驗采用5%甲醛過濾海水溶液,-20°C冰凍和液氮保存3種保存方法。甲醛保存法,用GF/F玻璃纖維濾膜過濾的海水與分析純的甲醛配制成體積比為95︰5的甲醛過濾海水溶液。將已經測量完鮮重的浮游動物樣品用鑷子輕輕地轉移到容積為10ml的小試劑瓶中,加入 5ml濃度為 5%的甲醛過濾海水溶液在陰涼處保存。-20°C冰凍保存法,實驗中將已測量完鮮重的樣品平鋪于篩絹上,將篩絹放于5ml的凍存管中于-20°C條件下進行保存。液氮保存法與-20°C冰凍保存法的處理方法相同。

每種保存方法的最長保存時間為60 d,分別設置0、1、3、5、7、10、15、20、25、30、35、40、45、50、60 d共15個測量時間點,每個時間點設置a,b兩個平行樣。采集回來的樣品立即進行分類,挑取完整、健壯、活的個體,每個樣本大約20—30個個體(保證樣品干重至少達到 2mg)。用少量蒸餾水快速輕輕沖洗,去除生物體表的雜質和鹽分,再用吸水紙吸取生物體表面的水分,用 METTLER TOLEDO XS105精密天平測量鮮重(WF)。稱量后的樣品分別用甲醛,冰凍和液氮保存,在到達設定的時間點以后取出對應的樣品,其中甲醛保存的樣品采用上面同樣的方法清洗,稱量濕重(WW)。稱量后的個體置于事先處理好的稱量瓶中,放于烘箱中于60°C下干燥24h,然后于干燥器中冷卻,待樣品冷卻到室溫以后測量干重(WD),再用德國Vario EL Ш元素分析儀測定C、N含量W(C)、W(N)。得到WF、WW、WD和W(C)、W(N)分別與樣品初始的WF作比,用WW/WF,WD/WF,W(C)/WF和W(N)/WF表示,與保存時間作圖分析其變化。

2 結果

2.1 中華哲水蚤在幾種保存條件下的生物量變化

中華哲水蚤在甲醛、冰凍和液氮3種保存條件下的生物量變化如圖2所示。中華哲水蚤在上述3種保存條件下,WW呈現出不同的變化趨勢。在甲醛保存條件下,其WW在保存的前幾天急劇地上升,達到了WF的127.6%,之后不斷下降,在2個月后下降為WF的81%;在冰凍保存條件下,其WW呈一直下降的趨勢,2個月后下降為WF的66.6%;在液氮保存條件下,中華哲水蚤的WW呈現先下降后上升的趨勢,在保存 2個月后為WF的91.9%。

中華哲水蚤在甲醛保存條件下,其WD在保存初期呈現出 1個小的上升,之后下降,后趨于穩定,在保存2個月后變為WF的14.2%;在冰凍保存條件下,WD變化趨勢與在甲醛保存條件下的變化趨勢相同,但是下降幅度比在甲醛保存條件下要小,在保存2個月后,WD變為WF的22.34%;在液氮保存條件下,WD呈現上升的趨勢,保存2個月后為WF的26.7%。

對于中華哲水蚤,其W(C)在 3種保存條件下的變化趨勢與W(N)相同。在5%的甲醛保存條件下,中華哲水蚤的W(C)、W(N)含量先下降后趨于穩定,保存 2個月后W(C)/WF和W(N)/WF分別為 7.03%和1.20%;冰凍保存條件下,W(C)、W(N)先短暫上升后下降,再趨于穩定,保存 2個月后W(C)/WF和W(N)/WF下降為10.3%和2.15%;在液氮保存條件下,W(C)、W(N)呈現出穩定上升的趨勢,在保存 2個月后W(C)/WF和W(N)/WF分別為11.3%和2.41%。

綜合分析發現,中華哲水蚤的WW在3種方法保存2個月后都有不同程度的下降,其下降程度分別為冰凍＞甲醛＞液氮。與新鮮樣品相比,甲醛保存2個月后的樣品,其WD和W(C)、W(N)都降低了,分別下降了 29.4%、23.01%和43.3%。而冰凍和液氮保存2個月后的樣品,其WD和W(C)、W(N)有所上升。WD、W(C)、W(N)在冰凍保存條件下,分別上升了11.14%、12.88%、1.94%;在液氮保存條件下,分別上升了32.59%、23.26%、14.65%。

圖2 中華哲水蚤各生物量指標在5%甲醛、-20°C冰凍和液氮保存條件下的變化Fig.2 Changes in biomass of Calanus sinicus preserved in 5% formalin,-20°C in liquid nitrogen

利用SPSS統計軟件中的Duncan法,對中華哲水蚤在5%甲醛,-20°C和液氮3種保存條件下的的生物量變化進行方差分析和多重比較,不同處理結果的差異顯著性用標記字母法表示,如表1所示,相同的字母表示不同的處理之間的差異性不顯著,不同的字母表示不同的處理之間具有極顯著的差異,如果某一處理的結果是兩個字母的組合,例如AB,而另2組處理的結果分別是組成上述字母組合的某一個字母,即分別為A和B,則表明前一處理分別與后兩種處理之間均沒有顯著性差異。經Duncan檢驗,上述3種保存方法對中華哲水蚤的WW和WD的影響,存在極顯著性差異(P＜0.01),對中華哲水蚤W(C)和W(N)的影響無顯著性差異(P＞0.05)。5%的甲醛保存對中華哲水蚤WW和WD的影響與-20°C冰凍和液氮保存之間存在顯著性差異,而后兩種保存方法之間無顯著性差異。5%甲醛保存導致中華哲水蚤WW的下降程度比-20°C冰凍和液氮保存小,5%甲醛導致中華哲水蚤WD的下降程度比-20°C冰凍和液氮保存大。

表1 中華哲水蚤在5%甲醛、-20°C、液氮3種保存條件下生物量變化的多重比較Tab.1 Changes in biomass of Calanus sinicus preserved in 5%formalin,-20°C in liquid nitrogen

2.2 強壯箭蟲在幾種保存條件下的生物量變化

在甲醛保存條件下,強壯箭蟲的WW、WD、W(C)和W(N)呈現出先上升再下降后上升的趨勢(圖3),在保存到大約第3—5d的時候,各生物量指標有一個小的上升,之后下降,在第7—10d的時候下降到最低點,然后再上升,在保存2個月后WW較WF上升了4%,與新鮮樣品相比,WD、W(C)和W(N)分別下降了44.3%、44.4%和51.5%。在冰凍保存條件下,WW、WD、W(C)和W(N)一直呈現下降的趨勢,WW起初變化比較緩慢,在第10d左右開始急劇下降,WD、W(C)和W(N)從保存的第1d左右開始急劇下降,之后緩慢下降,在保存 2個月后,與新鮮樣品的各生物量指標相比,WW、WD、W(C)和W(N)分別下降了的29.3%、23.5%、23.1%和29.1%;在液氮保存條件下,WW、WD、W(C)和W(N)最初都呈現急劇下降的趨勢,WW和WD在保存到大約40d的時候下降到最低點,W(C)和W(N)在大約第7d的時候下降到最低點,之后各生物量指標又略有上升的趨勢,在保存 2個月后,與新鮮樣品的各生物量指標相比,WW、WD、W(C)和W(N)分別下降了26.85%、 30.74%、 16.74%和20.97%。綜合分析發現,強壯箭蟲的WW在甲醛保存2個月后上升為WF的104%,而在冰凍和液氮保存2個月后分別下降為WF的70.7%和73.2%。WD在3種保存條件下保存2個月后的下降幅度大小為:5%的甲醛＞液氮保存＞-20°C冰凍。W(C)和W(N)的下降幅度大小為:5%的甲醛＞-20°C冰凍＞液氮。

圖3 強壯箭蟲生物量在5%甲醛、-20°C冰凍和液氮保存條件下的變化Fig.3 Changes in biomass of Sagitta crassa preserved in 5% formalin,-20°C in liquid nitrogen

利用 Duncan法,對強壯箭蟲在 5%甲醛,-20°C和液氮 3種保存條件下的生物量變化進行方差分析和多重比較,結果如表2所示。經Duncan檢驗,上述3種保存方法對強壯箭蟲生物量的影響存在顯著性差異(P＜0.05),其中對WD的影響存在極顯著性差異(P＜0.01)。經過多重比較,-20°C冰凍保存導致強壯箭蟲WW的損失程度比液氮小,與5%甲醛相比,2種保存方法之間無顯著性差異,5%甲醛保存和液氮保存對強壯箭蟲WW的影響不存在顯著性差異。5%甲醛保存導致強壯箭蟲WD的損失程度比-20°C冰凍保存和液氮保存大,-20°C冰凍保存和液氮保存對強壯箭蟲WD的影響不存在顯著性差異。5%甲醛導致強壯箭蟲W(C)的損失程度比-20°C 冰凍大,與液氮保存相比,2種方法之間無顯著性差異。-20°C冰凍保存和液氮保存對強壯箭蟲W(C)的影響不存在顯著性差異。5%甲醛保存導致強壯箭蟲W(N)的損失程度比液氮保存大,與-20°C冰凍相比,2種方法之間無顯著性差異,-20°C冰凍保存和液氮保存對強壯箭蟲W(N)的影響差異性不大。

表2 強壯箭蟲在5%甲醛、-20°C、液氮三種保存條件下生物量變化的多重比較Tab.2 Changes in biomass of Sagitta crassa preserved in 5%formalin,-20°C in liquid nitrogen

3 討論

本文采用膠州灣的優勢浮游動物中華哲水蚤和強壯箭蟲為研究對象,以WW、WD、W(C)和W(N)為生物量指標,研究了5%甲醛,-20°C冰凍和液氮3種保存條件對其生物量的影響。對于甲殼類中華哲水蚤而言,保存2個月后,3種保存方式都會導致其下降,但是甲醛保存的中華哲水蚤在保存之初會有一個上升,之后迅速下降,Mills(1982)在“保存方法對海洋底棲無脊椎動物的影響”一文中也指出大多數生物在甲醛保存時最初生物量會上升,之后下降。研究發現 3種保存條件下WW的下降幅度分別是冰凍＞甲醛＞液氮。中華哲水蚤在甲醛保存條件下,在保存之初WW的上升可能是由中華哲水蚤體表的幾丁質保護層等結構在甲醛的作用下通透性增加,甲醛保存液進入生物體內所導致的。之后WW下降可能是由中華哲水蚤的細胞膜等結構被破壞,體液流失量增加所導致的。而在冰凍和液氮保存條件下,WW一直下降的原因,推測是在保存過程中細胞膜受到損傷,體液流失造成的。導致中華哲水蚤WW出現以上變化趨勢的具體原因,還需要進一步的生理生化實驗驗證。與新鮮樣品相比,甲醛保存 2個月后,WD、W(C)和W(N)下降了,冰凍和液氮保存2個月后,其WD、W(C)和W(N)有所上升,增加幅度為液氮＞冰凍。從實驗結果分析發現不同的保存方法會導致浮游生物的生物量有不同的變化趨勢。Mills(1982)研究發現在10%的甲醛保存液中,只有雙殼類生物會出現明顯的生物量損失,而其他不同的生物則會出現生物量不同程度的上升或下降。Kalevi等(1979)研究了一種劍水蚤(Megacyclops gigas)在 4%甲醛、酸性魯格試劑、帶水在-20°C冰凍和用稀釋的甲醛溶液在-20°C保存后生物量的變化,研究表明,-20°C條件下用稀釋的甲醛溶液保存劍水蚤對生物量的影響最小,幾乎沒有損失,接近新鮮樣品的生物量,而4%甲醛和酸性魯格試劑,以及-20°C條件下用水保存的樣品則生物量損失較大。Fudge(1968)研究了新糠蝦類的Neomysis integer在保存后的生化成分變化,研究發現三氯乙酸(TCA)保存下的干重較新鮮樣品的WD要大,而蛋白質、脂質、碳水化合物等成分則有所下降。而冰凍保存后的Neomysis integer各種化學成分都有所上升,WD較新鮮樣品上升了13%,與本實驗的實驗結果較為相似。分析甲醛保存的樣品WD和W(C)先上升后下降,而W(N)一直下降的原因,可能是由于在保存初期,幾丁質保護層在甲醛的作用下通透性增加,甲醛保存溶液進入生物體內,同時體液流失導致小部分蛋白質或是氨基酸也通過細胞膜和體壁滲透到體外,保存初期甲醛保存液的滲透作用大于體液的流失作用,由于甲醛含有豐富的C元素,因此使得WD和W(C)出現一個上升趨勢,而W(N)則一直呈現下降趨勢,而保存后期,由于細胞結構的完全被破壞,體液的流失作用增強,因此WD和W(C)開始呈現下降趨勢。分析在冰凍和液氮保存下,WD、W(C)和W(N)上升的原因,結合文獻資料(Fudge,1968)發現,冰凍保存條件下,浮游動物的蛋白質、碳水化合物和脂質等成分都有所增加,導致WD的增加,具體原因尚不明確。而隨著保存時間的增加,冰凍條件下WD、W(C)和W(N)有所下降,推測可能是由某些耐冷微生物的繁殖消耗了部分的有機體導致的。而液氮條件下,極低的溫度有效地抑制了微生物的繁殖,因此液氮保存下的浮游動物WD、W(C)和W(N)沒有出現下降趨勢。以上是作者依據實驗結果,結合知識背景和查閱的資料,做出的推測和設想,導致中華哲水蚤WD、W(C)和W(N)出現以上變化的具體原因如何,還需要進一步的生理生化分析進行驗證。單純從生物量損失的角度考慮,若是測量WW,推薦使用液氮保存的方法,相較于另外2種方法,這種方法導致WW的損失最小。若是測量WD、W(C)和W(N),則推薦使用冰凍保存方法,因為冰凍保存后的樣品其生物量最接近真實的生物量,而且在最初的下降之后,其變化逐漸趨于穩定,波動幅度較小。若通過體型-生物量方程來間接估算生物量時,還需要考慮各種保存方法對浮游動物體型的影響,以及操作可行性。

對于毛顎類的強壯箭蟲而言,甲醛保存2個月以后,其WW大于WF。冰凍和液氮保存2個月后,其WW小于WF,其下降幅度為液氮＞冰凍。分析其原因,可能是由于強壯箭蟲其生理結構不存在幾丁質層的保護,而且在甲醛保存條件下強壯箭蟲的細胞膜被破壞,滲透調節功能消失,箭蟲體液的滲透壓大于甲醛溶液,導致大量水分進入箭蟲體內,以致出現WW大于WF的現象。而在冰凍和液氮保存條件下,強壯箭蟲的細胞膜被破壞,體液大量流失,因此使得WW下降。強壯箭蟲的WD、W(C)和W(N)在3種保存方式下保存2個月后,都分別小于新鮮樣品的各生物量指標,下降幅度分別為甲醛＞液氮＞冰凍,但是在液氮保存的后期,強壯箭蟲的WD、W(C)和W(N)略有上升。分析其原因,由于在3種保存條件下強壯箭蟲的細胞膜被破壞,體液大量流失導致WD、W(C)和W(N)出現了明顯的下降,而在液氮保存后期,WD、W(C)和W(N)的增加可能是由生物體和液氮及周圍環境之間發生了某些反應造成的,對導致此現象產生的原因還需要進一步的生理生化實驗來確定。關于保存方法對毛顎類動物生物量影響的相關報道較少,Makoto Omori(1978)用以硼砂為緩沖劑的甲醛溶液和以四氮六甲圜為緩沖劑的甲醛溶液對拿卡箭蟲(Sagitta nagae)進行保存,研究其對拿卡箭蟲生物量的影響,研究發現在以硼砂為緩沖劑的甲醛溶液中,保存前2.5天箭蟲的有機質和化學成分含量下降劇烈,之后變緩,保存1周后箭蟲有機質的損失達到21%,C損失34%,N損失49%,W(C):W(N)由8.5變為11.0,保存1個月后生物量達到穩定,損失速率幾乎變為0。以四氮六甲圜為緩沖劑的甲醛溶液中,在保存的前0.5 d,生物量和各化學成分迅速下降,之后的2d,生物量又有所上升,之后生物量緩慢下降,保存1周后,箭蟲損失了13%的C和26%的N,但是有機質的損失非常的小。浮游動物在以四氮六甲圜為緩沖劑的甲醛溶液中比在以硼砂為緩沖劑的甲醛溶液中的生物量損失要小。單從生物量方面考慮,若是測量強壯箭蟲的WW,推薦使用甲醛保存方法,因為相較于另外2種保存方法,甲醛保存下的強壯箭蟲,其WW最接近其真實值,而且變化也最穩定,若是測量WD、W(C)和W(N),推薦使用冰凍保存方法,因為其WD、W(C)和W(N)損失最小,其次是液氮保存。但是同樣,若采用體型-生物量方程間接估算其生物量,則需要綜合考慮其各種保存條件對體型的影響。在實驗過程中發現,甲醛保存對強壯箭蟲體型的影響最小,也最穩定,而且操作起來也最簡單,適合大樣本的研究。因此在選取一定的保存方法對強壯箭蟲的生物量進行研究時,要根據實驗目的和實驗可操作性等因素進行綜合考慮和選擇。

查閱國內外的相關資料并結合本實驗綜合分析可以得出,不同的保存方法會導致浮游動物生物量出現增加和降低不同的變化趨勢,而且增加和降低的幅度也有所差異,這與采用的保存劑,保存條件、保存溶液的量,以及不同的保存方法對不同的浮游動物作用機理不同等原因有關,而且在操作過程中不同的操作方法,也會導致實驗結果存在一定的差異。實驗發現浮游動物的生物量在保存的初期變化比較明顯,之后逐漸趨于穩定,這與 Beers等(1976)的實驗結果相似。各種保存方法對中華哲水蚤生物量的影響要小于強壯箭蟲,這可能與甲殼類生物表面的幾丁質保護有關,有效地抑制了體液的流失。經各種保存方法處理后,浮游動物 N的損失量要大于 C,這與許多已發表的研究結果類似(Williamset al,1982,Champalbertet al,1979)。據推測,保存樣品中N的流失主要是由于一些自由氨基酸和小分子的含 N分子造成的,這些富含 N的物質用來維持細胞內的滲透壓(Beers,1976)。

本文選取中國近海兩種重要的浮游生物中華哲水蚤和強壯箭蟲為研究對象,通過研究了解 5%甲醛、-20°C冰凍和液氮3種不同的保存條件對中華哲水蚤和強壯箭蟲生物量的影響,為更為準確地估算其生物量的真實值提供了一定的矯正因子,也為在不同條件下選取合適的保存方法提供了依據。中國近海浮游動物種類豐富,不同的浮游動物種類之間存在生理生化結構上的差異,因此不同種類的浮游動物在相同的保存條件下,生物量變化存在很大的差異。除本文所研究的這3種常見的浮游動物保存方法外,不同濃度下的甲醛和乙醇,以及添加不同緩沖劑的甲醛溶液也是常見的浮游動物保存方法。在以后的研究中,會進一步增加不同的保存條件對中國近海海域更多浮游動物優勢種類生物量的影響的研究,為全面、準確地估算中國近海優勢浮游動物的生物量提供理論支持。

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