鰻弧菌對魁蚶血細胞形態及免疫功能的影響*

周麗青 楊愛國① 王清印 呂振明 劉志鴻 田吉騰 吳 彪

(1．中國水產科學研究院黃海水產研究所 農業部海洋漁業可持續發展重點實驗室 青島 266071;2． 浙江海洋學院 舟山 316000)

商品規格魁蚶(Scapharca broughtonii)或鮮食,或加工為干制品,肉質鮮美,營養豐富。20世紀以前,我國魁蚶野生資源豐富,但常年的濫采亂捕和環境污染,導致該貝野生資源驟減,雖然它的人工育苗及養成研究早有成功范例,但一直都不屬于主流養殖物種。近年來,因適應性強、生態修復效果顯著的特點,魁蚶人工養殖發展迅猛,為防止發生類似于扇貝、鮑魚和牡蠣等長期單一品種高密度養殖模式下,水質惡化、養殖品種生長緩慢和病害暴發,我們開展了魁蚶種質資源和遺傳多樣性(吳彪等,2012;梁超等,2010,2011;周麗青等,2012;Tianet al,2012)、生長(吳彪等,2012)、血細胞類型(周麗青等,2013)及形態選育指標(吳彪等,2010)等良種培育的研究,發現魁蚶對致病弧菌的抵抗能力強,具有很高的抗逆性能,為培育魁蚶抗病抗逆新品系,作者觀察鰻弧菌(Vibrio anguillarum)免疫刺激前后血細胞形態變化及相應的免疫功能,以期為魁蚶種質改良積累免疫參數。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

18只3齡健康魁蚶購自山東青島南山水產品市場,殼長 70—80mm,體重 110—150g。水溫 18—22°C 暫養1周左右,投喂硅藻、扁藻和金藻,每天換水1次。

1.2 鰻弧菌免疫刺激魁蚶血細胞

鰻弧菌菌種由中國海洋大學海洋生命學院提供,2611E海水培養基培養。魁蚶3只一組,采用一次性1ml注射器斧足注射 1×109個/ml鰻弧菌生理鹽水溶液0.1ml,3只不注射的作為健康對照組,分別于注射3—4h,6—10h,12—16h,24—30h和48h后取血淋巴液。

1.3 血細胞分類和形態觀察

血淋巴液制片方法參照劉志鴻等(2003)。前閉殼肌血竇中抽取血淋巴液,選Alserver液(18.7g/L葡萄糖,8g/L檸檬酸三鈉,0.5g/L檸檬酸,4.2g/L NaCl)和MAS液(20.8g/L葡萄糖,8g/L檸檬酸三鈉,3.36g/L 乙二胺四乙酸二鈉;22.5g/L NaCl)為抗凝劑。制備的血涂片用南京建成科技有限公司快速瑞氏-吉姆薩染液染色,LeicaDM4000B光學顯微鏡下觀察拍照。

2 結果

2.1 紅細胞形態變化及其免疫功能

魁蚶紅細胞在顯微鏡下呈中間厚邊緣薄圓形或橢圓形餅狀,胞質中黑色顆粒推測為血紅蛋白顆粒;經鰻弧菌免疫刺激后,紅細胞常現無絲分裂和不等縊裂(見圖1),注射12h后更多見,圖1a為紅細胞吞噬或胞吐血紅蛋白顆粒;圖1b為剛完成分裂的紅細胞,血紅蛋白近乎平分;有時細胞核不等縊裂(圖1c),有時細胞分裂為大小不等2個(圖1d);有的細胞核不分裂,胞質縊裂球中無細胞核,血紅蛋白顆粒不等分配(圖1e,圖1f),具細胞核的小分裂球有時小至5μm左右(圖1g),有些小分裂球中不含血紅蛋白顆粒(圖1h)。紅細胞在 2種抗凝劑及無抗凝劑的血淋巴液中的形態無明顯差異。

圖1 魁蚶紅細胞的無絲分裂和縊裂Fig.1 The amitosis and strangling division of red cells in hemolymph of Scapharca broughtonii

魁蚶紅細胞對侵入血淋巴液的病原菌有吞噬作用,病原菌首先黏附在近旁的紅細胞膜上(圖2a),紅細胞吞噬病菌并形成包囊(圖2b),吞噬病原菌的部位常以縊裂方式從細胞母體中分離出來(圖2c,圖2d,圖2e);注射24h后,被吞噬的鰻弧菌以吞噬泡的形式懸掛于細胞膜表面(圖2f);注射12h之前,紅細胞表面對病原菌有明顯的免疫吸附功能,注射3—4h后即可見個別紅細胞表面吸附大量病原菌(圖2g),隨著血淋巴液中病原菌被吞噬減少,很少見紅細胞表面吸附病原菌,制片過程可能會使細胞表面免疫吸附的病原菌脫落,細胞表面呈現白色空洞(圖2h)。

2.2 白細胞形態變化及其免疫功能

白細胞在抗菌免疫中起著極其重要的作用,注射病原菌12h后白細胞數目明顯增多。嗜堿性細胞吞噬大顆粒異物(圖3a);嗜酸性和嗜中性細胞則是吞噬病原菌的主力,白細胞之間易粘連,尤其 MAS液中,發生吞噬作用的白細胞易相互粘連甚至融合(圖3b),白細胞間的粘連常參與血栓的形成;被白細胞吞噬的病原菌不能立即被消化分解,它們在白細胞內仍能存活一段時間,并企圖從白細胞中掙脫出來,致使細胞表面形成各種不規則突起(圖3c);白細胞具有變形運動能力(圖3d),可移動到病原菌附近實施吞噬;注射24h后,病原菌被白細胞消化分解后呈細絲狀或液化,消化泡從白細胞中縊裂出來,游離于血淋巴液中(圖3e);白細胞也有免疫吸附作用,可吸附并快速吞噬大量病原菌(圖3f,圖3g);白細胞中的淋巴細胞一般不具備吞噬病原菌的作用,可能會向血液中分泌抗體,淋巴細胞核常見有缺刻(圖3h)。

圖2 魁蚶紅細胞對病原菌的免疫作用Fig.2 The immune function for pathogen of red cells in hemolymph of Scapharca broughtonii

圖3 白細胞形態變化及其吞噬作用Fig.3 The morphological change of white cells and their phagocytic function

2.3 血栓細胞形態變化及其功能

正常情況下血栓細胞呈長梭形,細胞核呈圓梭形(圖4a),未抗凝或注射病原菌后,血栓細胞之間容易相互粘連(圖4b),注射病原菌3—4h后,血淋巴液中游離的血栓細胞數量急劇減少,且形態變得極不規則,多已參與凝血。血栓細胞啟動凝血機制時細胞膜邊緣不清晰,細胞核周圍出現大量細絲狀物質類似不溶性纖維蛋白(圖4c),逐漸彌散開來;血栓細胞間相互交織粘連(圖4d),纖維蛋白彌散交織后,有些細胞核會略有變形,逐漸增多的纖維蛋白交織成網后網住周圍的血細胞形成血栓塊(圖4e);血栓細胞偶爾黏附或吞噬病菌(圖4b,圖4f)。注射病原菌后,MAS液中,血栓細胞形態相對正常(圖4a,圖4b),Alserver液中血栓細胞的形態常發生改變,細胞核形態膨脹彌散開來(圖4c,圖4d,圖4e)。

圖4 血栓細胞形態變化Fig.4 The morphological change of thrombocytes

3 討論

3.1 血細胞的無絲分裂和縊裂

無絲分裂(amitosis)又稱直接分裂,動物血細胞的無絲分裂存在以下4種情形:(1)細胞物質代謝旺盛,通過無絲分裂增大細胞核的表面積;(2)已分化細胞中無絲分裂多見;(3)不良環境與老化導致細胞發生無絲分裂;(4)組織再生時,細胞的無絲分裂會增多(張警愚,1989)。在本研究中,注射病原菌 12h以后,紅細胞無絲分裂和縊裂現象增多;注射24h之后,白細胞縊裂增多,說明不同血細胞分裂功能不同,紅細胞的無絲分裂是為了增加運輸氧氣,增強機體抵抗病菌入侵的能力,同時補充因為吞噬病原菌而死亡的紅細胞數目;白細胞的縊裂可能是為了減少負擔,以便繼續吞噬病菌。鄒拓謎等(2011)認為多倍體的野生鯽(Carassius auratus)通過血細胞的無絲分裂來增加細胞數量,保證其總血紅蛋白含量相對穩定,從而確保它們運輸氧氣的能力。胡知淵等(2005)推測較多的紅細胞數量會刺激棘胸蛙(Pana spinosa)紅細胞的無絲分裂。羅芬等(2010)認為疫苗能夠誘導中華倒刺鲃(Spinibarbus sinensisBleeker)外周血紅細胞、單核細胞和中性粒細胞等具有吞噬功能的細胞數量增加,來增強其吞噬功能。注射12h后,魁蚶白細胞數目明顯增多,但未觀察到白細胞分裂增生的過程,這是因為血細胞起源于造血干細胞,而單純的形態學方法難以辨認造血干細胞(李長玲等,2009)。

3.2 魁蚶血細胞對病原菌的免疫功能

魁蚶血淋巴液中 3大類細胞在受到鰻弧菌免疫刺激后都發生形態改變,筆者認為屬于免疫防御的應激反應。多數研究人員認為吞噬作用主要由粒細胞完成(Carballalet al,1997;Moore,1972;李太武等,2007),魁蚶的紅細胞、各種白細胞和血栓細胞都具有吞噬病原菌的功能,紅細胞先表現出免疫黏附功能,與魏靜等(2010)和張振冬等(2006)對魚類紅細胞免疫黏附功能的研究結果一致;注射鰻弧菌一段時間后,魁蚶紅細胞又表現一定的病原菌吞噬功能;白細胞是吞噬病原菌的主力軍,血栓細胞偶有吞噬病原菌作用,且注射病原菌后,二者共同參與血液的凝固過程。Burrows等(2001)觀察發現大菱鲆(Psetta maxima)血栓細胞除具有凝血功能外,還具有吞噬功能;路衛星等(2008)觀察的幾種變溫脊椎動物血栓細胞形態及功能與魁蚶的較為一致;綠海龜(Chelonia mydas)的血栓細胞細胞質邊界模糊的特性也與魁蚶的較為相似;貝類中除朱澤聞等(2011)和張維翥等(2005)推測存在特化的血栓細胞起凝集作用外,尚未見有血栓細胞的報道。本研究發現,魁蚶血細胞分工明確,能共同防御病原菌的入侵,細胞免疫對病原菌免疫防御起極其重要的作用,是否存在體液免疫或體液和細胞共同免疫有待進一步研究。今后可借鑒王日昕等(2009)構建的高質量血細胞 cDNA文庫進行 Expressed sequence tag(EST)序列分析,深入研究魁蚶免疫相關因子和免疫機制。

3.3 2種抗凝劑對魁蚶血細胞形態的影響

Hindriks等(1992)認為血栓細胞形態變化受外界無機離子濃度影響較大,本研究發現 Alserver液和MAS液對阻止血液凝固都有一定的作用,Alserver液中血栓細胞易變形,細胞邊緣不清晰,MAS液中,血栓細胞形態輪廓光滑可辨;相反,Alserver液中白細胞之間不粘連,細胞外形圓滑;MAS液中,白細胞之間易粘連,甚至融合,且細胞外形不圓潤,常有各種形狀突起。估計這2種抗凝劑改變了參與凝血的血細胞表面粘連特性,使血液無法凝固,因而起到抗凝作用。蔣瓊等(2001)篩選中國對蝦(Penaeus chinesis)血淋巴抗凝劑時,以能夠良好保持細胞的整體形態以及細胞器、細胞核形態為標尺。因此,研究魁蚶血細胞形態及免疫功能需選擇合適的抗凝劑。

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