養殖鱘魚出血癥病原魯氏耶爾森菌的分離鑒定和致病性研究*

李紹戊 王 荻 馮 娟 盧彤巖①

(1.中國水產科學研究院黑龍江水產研究所 哈爾濱 150070;2.中國水產科學研究院南海水產研究所 廣州 510300;3.農業部南海漁業資源開發利用重點實驗室 廣州 510300)

鱘魚(Acipenseriformes)屬世界性保護物種(謝忠明等,2002)。隨著鱘魚養殖關鍵技術的完善,鱘魚養殖產業得到快速發展。我國試養的鱘多達十幾種,目前形成規模養殖的種類主要有施氏鱘(Acipenser schrenckii)、西伯利亞鱘(Acipenser baerii)、鱘鰉雜交(Huso dauricus♀×Acipenser schrenckii♂)和 匙 吻 鱘(Polyodon spathula),約占鱘養殖總產量的 90%以上(孫大江等,2011)。但受到集約化程度快速提高、養殖水體污染嚴重、病害防治技術落后等諸多因素影響,養殖鱘魚爆發性疾病日趨嚴重,給生產及科研工作造成巨大損失和困擾(田甜等,2012)。

水產動物耶爾森菌病(yersiniosis)是由腸桿菌科耶爾森菌屬的魯氏耶爾森菌(Yersinia ruckeri)引起的,該菌可導致鮭鱒魚類發生腸炎紅嘴病(enteric redmouth,ERM),其主要癥狀為體表(尤其是頭、嘴、鰓蓋等部位)充血、腸道腫脹發炎等(Furoneset al,1993;Tobbacket al,2007)。研究表明,魯氏耶爾森菌主要為冷水性鮭鱒魚類的病原菌,但同樣感染其他魚類如鰱、鳙、鰻、金魚、鯉魚、鱘魚和羅非魚等,并導致魚類細菌性敗血癥,可同其他革蘭氏陰性菌如嗜水氣單胞菌、溫和氣單胞菌、豚鼠氣單胞菌等混合感染(Bercet al,1999;Danleyet al,1999;Eissaet al,2008)。在國內,徐伯亥等(1991)、范芳玲等(2010)先后報道了由魯氏耶爾森菌引起的魚類細菌性敗血癥,病魚體表多處出血,內臟伴有不同程度的發炎、充血。Vuillaume等(1987)首次從西伯利亞鱘中分離到魯氏耶爾森菌,病魚表現為嘴部、下頜、胸鰭及泄殖孔附近出血,并伴有腹水。2010年作者在河北某鱘魚養殖場進行流行病學調查發現一例施氏鱘出血癥,癥狀與已報道的耶爾森菌病相近,對發病鱘魚進行了病原分離鑒定,并進一步確定了病原菌的致病性。為了明確病原菌的分類學地位,本文采用生理生化方法和16S rRNA基因序列分析方法鑒定致病菌,并進行系統發育學分析。另外,通過感染魯氏菌后鱘魚病理組織切片觀察,來了解魯氏耶爾森菌對鱘魚的致病機理和感染途徑。

1 材料與方法

1.1 實驗材料與試劑

魚源魯氏耶爾森菌分離株(YR-H01)于2010年分離自河北某鱘魚養殖場患病鱘魚體內;實驗用施氏鱘購自中國水產科學研究院北京房山鱘魚繁殖中心,為非免疫狀態下(60±2)g實驗魚;實驗用TSA/TSB培養基、PCR所用試劑及特異性引物均購自上海生工生物工程有限公司;細菌基因組 DNA提取試劑盒購自天根生化科技有限公司;細菌生化微量鑒定管購自杭州天和微生物試劑有限公司。

1.2 方法

1.2.1 病原菌形態觀察及理化特征鑒定 室溫下解凍低溫冷凍保存的菌種,在無菌條件下,將細菌接種于TSA平板上,25°C恒溫培養24h。肉眼觀察菌落形態、大小、隆起度、顏色等,并利用透射電鏡(Hitachi-7650)觀察細胞的形態及鞭毛數量等;菌株各項生化指標的測定參照相關文獻進行(東秀珠等,2001)。

1.2.2 人工感染實驗及 LD50測定 將分離菌株YR-H01接種TSA于25°C恒溫培養24h后,用10mL pH 7.2的滅菌生理鹽水洗板,振動搖勻,稀釋至合適濃度備用。選取適當的稀釋系數,按照攻菌濃度從高到低依次設立A—H共8個實驗組,同時設立注射等比例生理鹽水的對照組Z進行摸索LD50實驗。每組隨機選取施氏鱘6尾,按照0.2mL/50g體重腹腔注射不同濃度菌液,分別于24h、48h及 72h后觀察記錄死亡情況及病理癥狀,同時按Reed-Muench法計算菌株半致死量(LD50)(Reedet al,1938)。

將魯氏菌稀釋至 LD50濃度并進行攻毒實驗,每組10尾,設空白對照組。剖檢實驗組死亡施氏鱘,觀察魚體內主要臟器的病理變化,并對72h仍存活的鱘魚取血及實質器官肝、腎進行細菌分離計數,同時對其肝、腎組織進行組織病理學檢驗。

1.2.3 16S rRNA序列測定及系統發育分析 將細菌接種于TSB中,25°C 220r/min震搖18h后離心收集菌體,按照細菌基因組 DNA提取試劑盒說明書提取細菌總DNA,作為PCR模板DNA。參考文獻,利用特 異性 引 物 Yer-F:5’-CGAGGAGGAAGGGTT AAGT-3’和 Yer-R:5’-AAGGCACCAAGGCATCTCT-3’對魯氏菌 16S rRNA 基因片段進行擴增(Cunninghamet al,2010)。PCR反應條件為:95°C預變性5min;94°C 變性 30s,55°C 退火 30s,72°C 延伸 1min,共 30個循環;最后 72°C延伸 10min。PCR產物經純化后由上海生工生物工程股份有限公司進行序列測定。

利用 BLAST 在線同源性查詢軟件查詢所測菌株 YR-H01的 16S rRNA序列的屬性,將其與從GenBank數據庫中獲得的耶爾森菌屬細菌及其他親緣關系相近的屬種的16S rRNA,采用Clustal W軟件進行多序列匹配排列(Multiple Alignments),用系統發生推斷軟件包 MEGA 4.0 進行系統發育分析。在Kimura-2-parameter模型的基礎上,用 Neighborjoining法構建分子系統樹,自舉分析(Bootstrap)1000次重復檢測分子系統樹的置信度,缺失和不確定的位點在計算中被省略。

2 結果

2.1 發病病例的流行情況及臨床特征

2010年 3月作者在河北省某鱘魚養殖場進行流行病學調查發現一例鱘魚出血癥,死亡率達到30%。養殖模式為水泥池流水養殖,發病水溫約 12—16°C,發病個體大小約300—500g。同時間在河南、北京周邊地區主要鱘魚養殖場也發現類似病癥,死亡率從10%至50%不等;結合近幾年的鱘魚主要病害流行病學調查工作,初步判斷為細菌性出血癥。病魚臨床癥狀表現為下頜、胸鰭、腹部及泄殖孔附近出血,并伴有腹水。解剖觀察發現病魚內臟器官有不同程度的出血,肝臟腫大、發暗,有出血點或出血斑,心臟呈花斑狀,脾臟紫黑色,腸道不同程度出血。

2.2 細菌形態特征

魯氏耶爾森菌YR-H01株在25°C培養24h后于TSA平板上形成表面光滑、邊緣整齊、微粘、淡黃色,直徑約1—2mm的圓形隆起的菌落。革蘭染色后鏡檢發現該菌株為革蘭氏陰性短桿菌(圖1a)。透射電鏡結果顯示,YR-H01株胞外有一層明顯的細胞膜,伴有褶皺。細胞直徑約 0.64μm,長度在1.7—2.5μm,細胞膜的厚度為0.12μm。每個細胞有5—8條周生鞭毛并錨定在細胞上(見圖1b)。

圖1 魯氏耶爾森菌YR-H01株形態觀察Fig.1 Morphological images of Y.ruckeri YR-H01

2.3 理化特征

常規理化分析表明,YR-H01株革蘭染色陰性,氧化酶反應陰性,氧化發酵陽性,具有運動性;其他理化特征見表1。生長條件測定結果顯示,YR-H01株生長溫度范圍為 20—37°C,最適生長溫度為25—30°C,在含鹽量 1%—3%的 TSA 培養基上能生長,生長的pH值范圍為5.0—9.0,最適pH值為7.0,且在28°C培養18h后細菌數目達到穩定期(圖2)。

表1 YR-H01菌株的生理生化特征分析Tab.1 Characteristics and biochemical reactions of the YR-H01 isolate

圖2 魯氏菌YR-H01株最適生長條件研究Fig.2 The optimum growth condition of Y.ruckeri YR-H01 strain

2.4 16S rRNA基因序列和系統發育學分析

PCR擴增YR-H01菌株的16S rRNA基因片段約500bp,測序結果表明該片段有 563bp,在 GenBank中的登陸序列號為 JQ657818。同源性檢索結果表明YR-H01菌株與耶爾森菌屬的魯氏耶爾森菌、克里斯坦森耶爾森菌以及小腸結腸炎耶爾森菌核苷酸同源性達到96.5%以上。

從NCBI核酸數據庫中選取16個水產動物致病菌株的16S rRNA基因序列進行系統發育學分析,結果如圖3所示,YR-H01與Y.ruckeri(HQ222844)、Y.kristensenii(NR025159)、Y.enterocolitica(NR041832)和Y.intermedia(NR027545)聚成一群,與它們的相似性分別達到98.5%、97.5%、96.4%和96.8%;另外,與愛德華菌屬的遲緩愛德華菌、斑點叉尾愛德華菌遺傳距離較近,而與黃桿菌親緣關系較遠。綜合常規生理生化和16S rRNA基因序列分析結果表明,YR-H01株鑒定為魯氏耶爾森菌。

2.5 LD50的測定及臨床觀察結果

當注射 0.2mL濃度為 1.5×108CFU/mL的菌液后,試驗魚的累積死亡率達到 100%;因此,確定分組區間為(0—3)×107CFU,所用稀釋倍數為 1.5。根據Reed-Muench法計算 YR-H01菌株半致死量(LD50)為7.2×106CFU(表2)。

經觀察發現,鱘魚感染魯氏耶爾森菌后,肛門紅腫外突明顯,且部分魚鰭基部和下頜處有出血現象。隨著攻菌濃度的升高,出現臨床病理癥狀的時間逐漸縮短,實驗A組6h開始有部分魚出現病理癥狀,8h癥狀普遍出現,9h第一尾魚死亡,對照組無死亡記錄。

圖3 基于16S rRNA基因序列的系統進化樹分析Fig.3 Phylogenetic relationship among Yersinia species based on 16S rRNA gene sequences

表2 人工感染不同濃度YR-H01株后試驗魚的死亡數量統計Tab.2 The cumulative mortality of fish injected with different concentrations of Y.ruckeri H01

對實驗組感染后死亡鱘魚進行剖檢可見,其腸道充血,腫脹,腸道內充滿黃色液體,部分魚有粘性分泌物。取對照組及感染后存活鱘血及肝、腎涂板進行細菌分離計數,結果表明:對照組三種組織中均未分離到魯氏菌,而實驗組肝、腎帶菌率為100%,且生化鑒定和分子鑒定結果表明重新分離到的菌株與感染的魯氏菌YR-H01株一致;血液未見細菌檢出。

2.6 病理組織觀察

由肝腎組織切片結果可見,感染后鱘魚腎臟無明顯病變(圖4a),腎細胞形狀及大小均正常,腎小管管腔形狀清晰可辨,無淋巴細胞及血細胞侵染,且管腔上皮細胞界線清晰,排列規則。對照組鱘魚肝臟組織切片(圖4b)觀察結果表明,對照組肝臟組織致密、結構清晰,具有完整的肝索、肝血竇等結構,肝細胞排列緊密,核呈圓形,位于細胞中央,細胞質飽滿,且細胞間竇狀隙明顯,其中充滿紅血球。而感染魯氏菌的魚肝組織出現明顯的淋巴細胞侵潤(圖4c),肝細胞的索狀結構消失,肝組織呈彌漫性壞死,肝細胞腫脹,肝細胞基本上失去了正常的多角形形狀,核空泡變性或核仁移向邊緣(圖4d)。有些肝細胞已經溶解變性,竇狀隙腔已彌散不可見。

3 討論

魯氏耶爾森菌是冷水性鮭鱒魚類、溫水性鯉科魚類等的常見病原菌之一。自上世紀50年代首次在美國養殖虹鱒體內分離到該菌以來(Rosset al,1966),其宿主范圍和地理分布均有明顯地擴大趨勢,其感染魚類主要包括鮭鱒科魚類、金魚、鰻鱺、鰈魚、鱘魚、鰱魚、鳙魚、斑點叉尾等,且在德國、法國、英國等歐洲各國及澳大利亞、中國均有所發現(Austinet al,2007),已成為對養殖魚類具有廣泛致病性的重要病原菌之一。本實驗首次從我國鱘魚主養區患出血癥的鱘魚體內分離、保存了魯氏耶爾森菌一株,命名為 YR-H01株,結合目前對魚類病原菌的鑒定方法,從形態觀察、理化特征分析及基因序列比對分析等方面對其進行研究(Nomotoet al,2004;孟彥等,2007;甘西等,2007),結果顯示YR-H01株的理化特征與已報道的斑點叉尾(Ictalunes punctatus)源菌株基本一致(范芳玲等,2010)。攻毒后,實驗魚有明顯出血癥狀,且可從發病魚的內臟組織再次分離到與原感染菌特性相同的致病菌株,確定該菌對施氏鱘具有致病性。而電鏡觀察菌株形態與Austin等(1999)報道的魯氏耶爾森菌基本一致。

圖4 魯氏耶爾森菌感染施氏鱘肝腎病理變化Fig.4 Pathological changes of livers and kidneys in Amur sturgeon after infection by YR-H01 strain

不同環境條件對細菌感染力有一定影響,而魯氏菌感染受溫度影響較大。15—18°C水溫對細菌感染有明顯影響(Roberts,1983);斑點叉尾鮰腹腔注射魯氏菌時,18°C感染及發病率遠高于22°C(Danleyet al,1999),表明較低水溫可增加魯氏菌致病性,加重感染程度(Fernandezet al,2007)。華北、東北地區是我國鱘魚人工繁育、苗種孵化的主要場所,這些地區多為溫冷水性養殖區,水溫 18—24°C 期間較長,需加強魯氏菌低溫易感菌的監控和監測工作。

隨著鱘魚養殖的產業化發展,因管理手段、養殖環境及水產品貿易等,導致病原傳播幾率大大增加,為魯氏耶爾森菌在鱘魚養殖地區的迅速傳播創造了條件,使該菌對鱘魚的潛在危害性增大。上世紀九十年代我國黑龍江、山東、北京等鱘魚主養區多次暴發發病急、發病率和死亡率高的不明疾病。1997至2000年間累計死亡魚苗約 30萬尾,死亡率高達 80%。病魚體側、腹部、鰓等部位出血,個別嚴重者可見吻部及口腔周圍出血;剖檢可見,肝、脾、腸道等有出血現象。組織病理研究表明患病魚肝組織病變嚴重,局部肝細胞壞死(曾朝輝,2003)。患病魚體表及內臟組織大面積出血、肝損傷及神經癥狀與魯氏菌病癥有許多相似之處。目前,鱘魚感染魯氏菌的報道較少,但危害極大,可導致60%以上的死亡率(Vuillaume et al,1987)。

近幾年,我國養殖鱘魚流行病學調查研究發現,每年 4—8月是耶爾森菌病的發病高峰期,其發病頻率及程度受溫度、水質等環境因子及魚體自身免疫力等因素的影響。因此,在鱘魚養殖過程中應加強對該細菌病的監控工作,從水質控制、養殖密度等方面預防疾病,以便及時采取有效的防治措施,避免該菌成為養殖鱘魚未來重要新病原的可能,并可適當選用喹諾酮類藥物進行早期防治,建立控制鱘魚耶爾森菌病的有效方法。

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