氟苯尼考在三疣梭子蟹(Portunus trituberculatus)疾病模型內的代謝動力學*

趙青松 金 珊 陳寅兒 秦方錦 王錫波 王國良

(寧波大學海洋學院 寧波 315211)

氟苯尼考(florfenicol)屬于酰胺醇類抗生素,為廣譜抑菌劑,對大多數革蘭氏陽性菌、革蘭氏陰性菌及支原體等有抑制作用,是我國當前畜禽和水產養殖業中應用較為廣泛的抗菌藥物之一(Samuelsenet al,1998;Stefanet al, 2004;徐力文等,2005;楊倩等,2010;黃緒玲等,2011;楊紅初等,2012)。近年來,國內外已有氟苯尼考在虹鱒(Oncorhynchus mykiss)、大黃魚(Pseudosciaena crocea)、鱈魚(Gadus morhua)、大西洋鮭(Salmo salar)、西伯利亞鱘(Acipenser baeri)、歐洲鰻鱺(Anguilla anguilla)、鲇魚(Silurus asotus)、異育銀鯽(Crucian carp)、中國明對蝦(Fenneropenaeus chinensis)、克氏原螯蝦(Procambarus clarkii)、南美白對蝦(Penaeus vannamei Boone)、中華鱉(Pelodiscus sinensis)等多種水產動物體內的代謝動力學及組織分布的報道(李靜云等,2004;Parket al,2006;楊倩等,2010;黃緒玲等,2011;王瑞雪等,2012) ,但至今未見其在蟹類體內代謝過程的有關資料。

三疣梭子蟹(Portunus trituberculatus)是中國海水養殖的主導品種之一,也是浙江省水產養殖的主要品種。但由于高密度養殖,使得疾病頻發,特別是由弧菌屬細菌引起的疾病,發病率一直居高不下(林克文,2002;王國良等,2006)。目前水產弧菌性疾病的防治仍是以藥物為主,而漁業用藥大都參考畜禽或健康水產動物的藥動學數據,這與生產實際情況存在較大差異。因此,為探明疾病對氟苯尼考在三疣梭子蟹體內代謝規律的影響,本研究在構建三疣梭子蟹溶藻弧菌疾病模型的基礎上(張櫻等,2010),比較研究了健康和疾病條件下氟苯尼考在三疣梭子蟹體內的代謝動力學及組織分布,以期為三疣梭子蟹合理用藥和休藥期的制定提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

三疣梭子蟹(P.trituberculatus)購于寧波莊市梭子蟹暫養場,體質量(90±25)g,共 220只,購回后于實驗室暫養,養殖用水采用海水晶配置,鹽度25±1,水溫(21±2)°C,pH 8.0±0.5。確定待檢測蟹各組織沒有藥物殘留后,挑選活潑健康個體進行實驗。實驗時間為15d,實驗期間連續充氣,每日換水50%,不投餌。

1.2 藥品及試劑

抗凝劑(檸檬酸鈉 8g/L,葡萄糖 20g/L,EDTA 3.36g/L,吐溫 80 100μL/L);氟苯尼考原料藥(含量10%,河南大明實業有限公司);氟苯尼考標準品(含量99.2%,中國獸醫藥品監察所)。

1.3 主要儀器

Agilent Technologies1200型高效液相色譜儀(美國Agilent公司),包括G1311A四元泵、G1314B紫外檢測器、G1311A柱溫箱、Chemstation色譜工作站、G1329A自動進樣裝置等;R206D旋轉蒸發儀。

1.4 溶藻弧菌疾病模型的構建

溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)由寧波大學海洋學院水產病害研究室提供。三疣梭子蟹溶藻弧菌疾病模型采用張櫻等(2010)方法構建。

1.5 給藥及采樣(余開等,2011)

以 25mg/kg劑量的氟苯尼考水溶劑分別對健康和患病三疣梭子蟹口灌給藥,無回吐個體用于實驗。在給藥后 0.25、0.5、1、2、4、6、8、12、24、48、72、96、120、168、240h采集血淋巴、肝胰腺和肌肉樣品。血淋巴與抗凝劑 1︰1混均后,4°C離心10min(3000r/min),收集上層血漿;肝胰腺和肌肉分裝于樣品袋中,所有樣品保存在–20°C冰箱。每個時間點各取5只蟹,實驗前取健康蟹組織做對照。

1.6 樣品前處理

自然解凍樣品后,準確取0.5mL血漿、0.5g經高速均質的肌肉和肝胰腺組織勻漿,加入 4mL的乙酸乙脂,在漩渦振蕩器上旋渦混勻 5min,4°C離心10min(6000r/min),取上層提取液至20mL離心管中。同法重復提取一次,合并兩次提取液,旋轉蒸發儀中45°C水浴蒸干后,加入1mL流動相,渦旋振蕩2min溶解殘存物,用0.45μm有機針頭濾器過濾,–20°C保存于樣品瓶中,高效液相色譜儀(HPLC)待測。其中,組織樣品提取液中加入適量正己烷用于溶解脂肪。

1.7 色譜條件

色譜柱:Diaimonsil TM–C18柱(150mm×16mm i.d.,填料粒度5μm);流動相:乙腈︰蒸餾水= 27:73(v/v),使用前用0.45μm微孔濾膜真空抽濾并超聲脫氣;流速:1.0mL/min;紫外檢測波長:223nm;柱溫:30°C;pH 7.0;進樣量:20μL。

1.8 標準曲線及檢測限

采用外標法測定。用流動相把氟苯尼考標準品配制成 100μg/mL儲備液,于–20°C避光保存。實驗時將儲備液稀釋成10、5、2、1、0.5、0.05μg/mL的標準工作液進行HPLC測定。以峰面積為縱坐標,藥物質量濃度為橫坐標制作標準曲線,求出回歸方程和相關系數后,按信噪比 S/N=2計算最低檢測限(LOD)。

1.9 回收率和精密度

采用加樣回收法。在適量的空白肌肉、血漿和肝胰腺中分別加入氟苯尼考儲備液并稀釋成0.5、1、5μg/mL(μg/g)系列理論濃度,按1.6方法進行提取和測定,每個濃度重復3次。相對回收率(%)=樣品實測濃度/樣品理論濃度×100%。將以上3個組織空白樣品的3個濃度于1d內的3個不同時間點重復進行測試,并連續測定3d,計算各組織中氟苯尼考的日內平均變異系數和日間平均變異系數。

1.10 數據處理

標準曲線回歸方程采用Microsoft Excel 2003軟件分析;藥時數據用3P97藥動學軟件處理。

2 結果

2.1 標準曲線及檢測限

氟苯尼考的標準溶液在0.05—10μg/mL質量濃度(X)之間與平均峰面積(Y)具有良好的相關性,線性回歸方程為Y＝32.51X+0.79,相關系數R2＝1。按信噪比S/N=2計算,本方法最低的檢測限是0.025μg/mL。

2.2 回收率與變異系數

氟苯尼考在三疣梭子蟹肝胰腺、肌肉、血漿三種組織中的回收率分別為(84.8±1.6)%、(88.0±8.9)%、(94.2±2.0)%,均大于80%;而在肝胰腺、肌肉、血漿三種組織中的日內變異系數分別為2.63、2.18、2.54,日間變異系數分別為3.67、3.23、4.61,均小于5%,說明用本實驗方法檢測氟苯尼考,回收率高而穩定。

2.3 氟苯尼考在健康和患病三疣梭子蟹三種組織中的濃度-時間變化

氟苯尼考在健康和患病蟹肝胰腺、肌肉和血漿三種組織中的藥時曲線見圖1—3。結果表明,氟苯尼考在健康和患病蟹相同組織中的代謝規律相似,給藥0.25h時,兩組蟹三種組織中均可檢測到藥物的存在,且在肝胰腺中已達峰值,分別為6.85μg/g和3.32μg/g;隨后肝胰腺中的藥物濃度均顯著下降,實驗 2h時分別已降至峰值的 15.16%和 33.21%;此后肝胰腺中的藥物濃度保持在一定水平,至實驗 12h時分別出現第二個藥峰,健康組為 3.23μg/g,患病組為1.64μg/g。而肌肉和血漿中的藥物吸收和消除情況與肝胰腺明顯不同,實驗開始后藥物濃度逐漸上升,健康組肌肉和血漿均于實驗 2h時達峰,而患病組肌肉和血漿分別于實驗2h和4h達峰,其后逐漸下降。實驗24h后,各組織藥物消除速率均趨緩,健康組和患病組分別在實驗168h和240h時藥物濃度基本維持在0.1μg/mL以下,98.6%以上的藥物被代謝、轉移或排泄出機體。

圖1 氟苯尼考在三疣梭子蟹肝胰腺中的藥時曲線Fig.1 Change of florfenicol concentration with time in hepatopancreas of P.trituberculatus

圖2 氟苯尼考在三疣梭子蟹肌肉中的藥時曲線Fig.2 Change of florfenicol concentration with time in muscle of P.trituberculatus

圖3 氟苯尼考在三疣梭子蟹血漿中的藥時曲線Fig.3 Change of florfenicol concentration with time in plasma of P.trituberculatus

2.4 氟苯尼考在健康和患病三疣梭子蟹三種組織中的藥動學特征

健康和患病蟹三種組織中的藥時數據經3P97藥動學軟件分析后顯示,氟苯尼考在三種組織中的代謝規律均可用帶時滯的一級吸收二室開放模型來描述。藥動學方程和參數分別見表1和表2。與健康組相比,患病蟹肝胰腺藥物消除半衰期(T1/2β)、總體清除率(CLs)、表觀分布容積(Vd),肌肉藥物吸收半衰期(T1/2Ka)、達峰時間(Tpeak)、藥峰濃度(Cmax)、CLs、Vd,血漿藥物吸收速率常數Ka、T1/2Ka、T1/2β、Tpeak、Vd等藥動學參數均發生了顯著的變化(P＜0.05);而肝胰腺 Ka、T1/2Ka、Tpeak、Cmax、藥時曲線下總面積 AUC,肌肉Ka、T1/2β、AUC,血漿AUC、CLs等藥動學參數均發生了極顯著的變化(P＜0.01)。

表1 氟苯尼考在健康和患病三疣梭子蟹組織內的藥動學方程Tab.1 Equations of florfenicol concentration with time in healthy and diseased P.trituberculatus

表2 氟苯尼考在健康和患病三疣梭子蟹體內的藥動學參數Tab.2 Pharmacokinetic parameters of florfenicol in healthy and diseased P.trituberculatus

3 討論

氟苯尼考在健康和患病三疣梭子蟹肝胰腺、肌肉、血漿三種組織中的藥時曲線和藥動學數據顯示,健康和患病三疣梭子蟹三種組織對氟苯尼考的滲透性良好,吸收迅速;給藥后 0.25h三種組織中都已檢測到氟苯尼考,但以肝胰腺藥物濃度達峰最快并有二峰現象,肌肉次之,血漿最晚。這一現象與畜禽(蔣紅霞,2001;胡頂飛等,2002;劉帥帥等,2012)及魚類(Parket al,2006;王偉利等,2010;林茂等,2011;王瑞雪等,2012;葛建,2012)等的藥物代謝特征不同,但與余開等(2011)、唐俊等(2006)等研究的藥物在三疣梭子蟹和中華絨螯蟹體內的代謝及鄭重鶯等(2007)研究氟苯尼考在南美白對蝦體內的代謝特征類同。由于蟹類的消化系統構造與魚類等略有不同,其胃內有肝孔與肝胰腺相通,肝胰腺可以很快對藥物進行吸收、代謝轉化并向血淋巴、肌肉等組織轉移,而由于腸道也可吸收部分藥物,且蟹為開管式循環系統,因此造成了血淋巴藥物濃度達峰稍晚,肝胰腺藥物濃度出現二峰的現象(余開等,2011;唐俊等,2006)。

據報道,疾病會造成動物機體細胞、組織、器官的形態改變和生理功能障礙,從而影響藥物在動物體內的吸收、分布、代謝和排泄等過程(Baggot,1980)。Uno(1996)研究表明土霉素在患弧菌病香魚體內的生物利用度會顯著下降;劉彥等(2006)和余開等(2011)分別在牙鲆和梭子蟹對藥物的代謝研究中發現,細菌感染會導致藥物在機體主要組織中的代謝規律明顯改變,藥物的吸收、分布和消除減慢;此外,其他學者在研究山羊(劉滌潔等,2003)、雞(張秀英,2001;黃顯會等,2003)、豬(曾振靈等,1996)等動物對藥物的代謝時也證實,患病情況下動物對藥物的吸收速度明顯減慢,吸收量下降,消除延緩。本實驗結果顯示,氟苯尼考在健康蟹和患病蟹相同組織中的藥時曲線形態相似,代謝過程均可用帶時滯的一級吸收二室開放模型來描述,這與劉彥等(2006)和黃顯會等(2003)的研究結論基本一致。與健康蟹相比,患病蟹三種組織對氟苯尼考的吸收速度和吸收率明顯下降,半衰期顯著延長,清除率顯著下降,藥時曲線下總面積和表觀分布容積變大,說明弧菌感染已對三疣梭子蟹主要組織器官造成了損害,特別是肝胰腺發生了功能性障礙,肝代謝轉化酶活性下降,藥物不可逆消除減慢。此外,本實驗中感染蟹Vd的增大,也說明病理狀態能降低藥物與血漿蛋白的結合率,使其在組織中分布更加廣泛,有利于疾病的治療(蘇成業,2003)。若以國家動物性食品中氟苯尼考最高殘留限量 0.1mg/kg為標準,從圖1—3可看出,健康蟹和感染蟹給藥后分別需168h和240h,三種組織中的氟苯尼考含量才會下降到0.1mg/kg以下,因此,建議三疣梭子蟹口服氟苯尼考的休藥期應在10d以上。

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