IL-17A 基因rs8193037 和rs1974226 位點多態性與重癥肌無力的相關性研究

王 琦 ，岳耀先，洪 宇，謝琰臣，郝洪軍 張賢軍，谷傳凱，高 翔，張 栩，李海峰

重癥肌無力(myasthenia gravis，MG)是主要由乙酰膽堿受體(AChR)抗體介導細胞免疫及體液免疫系統共同參與的自身免疫疾病。實驗性變態反應性重癥肌無力(experimental autoimmune myasthenia gravis，EAMG)研究發現Th17 細胞參與MG 發?。?］。IL-17A 是Th17 細胞產生的細胞因子，其基因位于人類第6 號染色體上。已有研究證實IL-17A 的濃度與EAMG 的肌無力嚴重程度有關［2］;伴胸腺瘤的MG 患者血清IL-17A 及其mRNA 水平也顯著高于健康對照組［3］。

本研究通過對 MG 患者的 IL-17A 基因rs8193037 及rs1974226 位點進行分型，探索其與MG 易感性和嚴重程度的相關性。

1 研究對象與方法

1.1 研究對象 納入2007 年11 月～2013 年6 月在青島大學醫學院附屬醫院及北京友誼醫院診治隨訪的MG 患者480 例，患者間無親緣關系，符合MG 的診斷標準［4］。對照組隨機選取同地區健康查體人員487 例，均為中國北方漢族人口，與患者無親緣關系，排除慢性感染性疾病及自身免疫疾病。本研究獲得各自醫院的倫理委員會同意，納入的MG患者均知情同意。納入的患者每年至少隨訪兩次，并在病情加重時及調整治療后2～3 個月內均有隨訪。MG 組按發病年齡［5］、合并胸腺瘤與否(胸腺CT 及/或胸腺病理證實)、AChR 抗體、首發受累范圍(眼肌型/全身型)、發病后兩年間最重受累范圍及最重時嚴重程度(Oosterhuis 評分)［6］，分成亞組。自然史研究發現82%的MG 患者發病2 y 內發展到疾病最嚴重程度［7］，故我們對病程2 y 以上且資料充分者，分析其最重時的受累范圍和Oosterhuis 評分。

1.2 方法

1.2.1 實驗方法 選取位于6 號染色體5’端啟動子調節區的rs8193037 位點及3’端轉錄非翻譯區的rs1974226 位點［8，9］，兩位點在中國人群中最小等位基因頻率(MAF)均≥0.05(Hapmap，CHB 數據庫)。采用上海天昊生物科技有限公司SNPscanTM技術進行基因分型［10］。隨機選取4%的樣本進行雙盲質控，質控結果與原分型結果一致。

1.2.2 統計方法 采用χ2檢驗或Fisher 精確檢驗比較MG 組與對照組、各MG 亞組與對照組及MG 亞組間等位基因頻率的差異(SPSS17.0 軟件，P＜0.05 認為差異有統計學意義)。使用在線軟件SNPstats 進行對照組的Hardy-Weinberg 遺傳平衡檢驗，在共顯性與加性遺傳模型下比較MG 組與對照組、各MG 亞組與對照組以及MG 亞組間基因型頻率的差異，并使用SNPstats 內置的Logistic 回歸程序在共顯性與加性遺傳模型下帶入性別、發病年齡、胸腺情況、AChR 抗體和首發受累范圍等因素進行校正。使用Haploview 4.2 軟件進行連鎖不平衡分析。使用PGA 軟件(http://dceg.cancer.gov/tools/analysis/pga)計算統計效力。

2 結果

2.1 MG 組與對照組一般資料 480 例MG 患者中男189 例，女291 例;發病年齡1～86 歲(中位數40 歲，四分位間距32 歲)，＜15 歲者71 例，15～50 歲者253 例，＞50 歲者156 例;胸腺瘤者107 例，不伴胸腺瘤者367 例，無資料者6 例;AChR 抗體陽性者338 例，陰性者124 例，無資料者18 例。發病時為眼肌型者342 例，全身型者135 例，無資料者3例。MG 組患者總病程8～220 個月(中位數43 個月，四分位間距61 個月)，每年平均隨訪6.5 次。有發病后2 y 間最嚴重時受累范圍資料者425 例，眼肌型151 例，全身型274 例;有發病后2 y 間最嚴重時Oosterhuis 評分資料者370 例，0～2 分者216 例，3～5 分者154 例。對照組共487 例，其中男249 例，女238 例，年齡14～78 歲(中位數45 歲，四分位間距24 歲)。rs8193037 及rs1974226 位點分型成功率分別為98.55%和99.17%。對照組基因型分布均符合Hardy-Weinberg 遺傳平衡。

2.2 MG 整組及亞組與對照組比較 MG 整組與對照組兩位點的等位基因頻率和共顯性及加性模型下的基因型頻率均無顯著性差異(P ＞0.05，見表1)。亞組比較:rs8193037 位點的等位基因頻率和共顯性及加性模型下的基因型頻率在根據發病年齡、胸腺情況、抗體、首發受累范圍、2 y 間最重受累范圍和最重時Oosterhuis 評分劃分的各亞組間及各亞組與對照組比較均無顯著性差異。rs1974226 位點15～50 歲亞組T 等位基因頻率顯著低于＞50 歲亞組(P=0.007，OR=0.411，95% CI 0.217～0.778)，基因型頻率在共顯性及加性模型下有顯著差異(P=0.016 和P=0.0054)，采用logistic 回歸在共顯性及加性模型下校正性別、胸腺情況、抗體和首發受累范圍等特征后仍有統計學差異(P=0.023 及P=0.0089)。＜15 歲亞組與15～50 歲和＞50 歲亞組的比較以及各年齡亞組與對照組的比較，等位基因和基因型頻率均無顯著性差異(P ＞0.05，見表2)。在等位基因頻率比較實際獲得的OR 值為0.411 且顯著性水平為0.05 時，15～50 歲和＞50 歲亞組比較的統計效力為44%。rs8193037 位點的等位基因頻率和共顯性及加性模型下的基因型頻率在其余亞組間及各亞組與對照組間均無顯著性差異(P ＞0.05，見表2)。

2.3 連鎖不平衡分析 MG 組與對照組總體，rs8193037 與rs1974226 的連鎖不平衡參數D’=0.79，r2=0.07，提示兩位點連鎖不平衡程度較低。

表1 rs8193037 及rs1974226 位點與MG 整組相關性分析

表2 rs8193037 及rs1974226 位點與MG 亞組相關性分析［例數(%)］

3 討論

Th17 細胞是一類獨立的CD4+T 細胞亞群，主要分泌細胞因子IL-17A，參與自身免疫反應、過敏反應、腫瘤免疫以及對抗細菌和真菌感染的宿主防御反應［11］。Th17 細胞在MG 的研究起源于干擾素γ缺陷鼠仍可發生EAMG 的報道［1］。Wang 等［2］進一步發現IL-17A 水平與EAMG 動物的肌無力嚴重程度相關。已有研究證實IL-17A 基因多態性與中國人群炎癥性腸?。?］及自身免疫性甲狀腺炎［8］相關，但IL-17A 基因多態性與MG 的易感性和嚴重程度的關系尚無報道。本研究選取的 rs8193037 及rs1974226 位點分別位于人類6 號染色體5’端啟動子調節區及3’端轉錄非翻譯區。啟動子能夠控制基因轉錄和表達的起始和程度，而轉錄非翻譯區影響mRNA 的剪切和穩定性，兩個位點發生變異可能會影響IL-17A 基因的轉錄，進而影響IL-17A 的濃度和功能。本研究的分型成功率＞98.5%，對照組中兩位點的基因型和等位基因分布均符合Hardy-wenberg 平衡。兩位點基因型頻率與Pubmed 基因數據庫中中國漢族人群的數據相近。兩位點連鎖不平衡程度低，也與Hapmap 數據庫數據一致。我們對性別、發病年齡、胸腺情況、AChR 抗體和首發受累范圍的亞組分析有助于支持MG 整組易感性分析的可靠性并探索關聯性更高的臨床特征;而2 y 間受累范圍和最重時Oosterhuis 評分亞組在一定程度上反映了MG 的嚴重程度。

rs8193037 位點的等位基因頻率和共顯性及加性模型下的基因型頻率在MG 整組、各亞組與對照組比較以及各亞組之間比較均無顯著性差異，提示該位點的多態性與MG 的易感性和嚴重程度無關。而rs1974226 位點的等位基因頻率和共顯性及加性模型下的基因型頻率在MG 整組與對照組無顯著性差異，僅兩個年齡亞組比較等位基因和基因型頻率有統計學差異，其余各亞組與對照組比較以及各亞組間比較均無顯著性差異。針對顯著性差異的亞組，采用logistic 回歸對潛在的混雜因素(性別、發病年齡、胸腺情況、AChR 抗體、首發受累范圍)進行校正發現仍有統計學差異，但僅局限在這兩個年齡亞組之間。但這兩個亞組等位基因差異的統計效力僅有44%，故認為該差異可能因亞組分析樣本量不足所致，且整組中無統計學差異，故不認為rs1974226位點與MG 的易感性和嚴重程度有關。

Mu 等［12］報道EAMG 存在Th1、Th2、Treg 及Th17 細胞比例的失調。Th17 細胞及IL-17A 在病程早期(致敏后14 d)水平變化不大，但病程晚期(致敏后42 d)顯著增高，且IL-17 對AChR 特異性T 細胞和分泌抗AChR 抗體的B 細胞的促進作用僅見于病程晚期，提示IL-17A 在MG 發病后維持和加強AChR 特異性免疫反應，從而影響MG 的嚴重程度。陸珺等［13］比較了93 例MG 患者與34 例健康對照者血清IL-17A 水平，未發現顯著性差異。Roche 等［14］報道全身型MG 患者血清IL-17A 水平高于健康對照，但主要由2 例伴胸腺異常者所致，眼肌型MG 患者與對照并無顯著性差異。我們對69 例未治療的MG 患者的研究發現血清IL-17A 水平與反映嚴重程度的QMG 評分正相關，但此研究中QMG 評分反映的嚴重程度為采集標本時的嚴重程度，與本研究中病程2 y 間最重嚴重程度不同。

綜上所述，本研究未發現IL-17A 基因rs8193037及rs1974226 位點基因多態性與MG 的易感性和嚴重程度有關。本研究的結果還需要其他獨立樣本的研究或匯總分析來進一步驗證。IL-17A 在MG 發病機制中的作用還需要結合MG 表型以及IL-17A 的遺傳學、免疫學和動物實驗研究來進一步闡釋。

［1］Zhang GX，Xiao BG，Bai XF，et al.Mice with IFN-gamma receptor deficiency are less susceptible to experimental autoimmune myasthenia gravis［J］.J Immunol，1999，162(7):3775 -3781.

［2］Wang W，Milani M，Ostlie N，et al.C57BL/6 mice genetically deficient in IL-12/IL-23 and IFN-gamma are susceptible to experimental autoimmune myasthenia gravis，suggesting a pathogenic role of non-Th1 cells［J］.J Immunol，2007，178(11):7072 -7080.

［3］王中魁，王 衛，陳玉萍，等.重癥肌無力胸腺瘤Th17 細胞及細胞因子變化［J］.中華內科雜志，2012，51(7):540 -542.

［4］王梓炫，李海峰，孫 亮，等.散發性重癥肌無力患者267 例維生素D 受體基因多態性［J］.中華神經科雜志，2011，44(7):473-478.

［5］Aarli JA.Myasthenia gravis in the elderly:Is it different［J］.Annals of the New York Academy of Sciences，2008，1132(1):238-243.

［6］Skeie GO，Pandey JP，Aarli JA，et al.TNFA and TNFB polymorphisms in myasthenia gravis［J］.Arch Neurol，1999，56(4):457-461.

［7］Grob D，Brunner N，Namba T，et al.Life time course of myasthenia gravis［J］.Muscle Nerve，2008，37(2):141 -149.

［8］Zhang X，Yu P，Wang Y，et al.Genetic polymorphisms of interleukin 17A and interleukin 17F and their association with inflammatory bowel disease in a Chinese Han population［J］.Inflamm Res，2013，62(8):743-750.

［9］Yan N，Yu YL，Yang J，et al.Association of interleukin-17A and -17F gene single-nucleotide polymorphisms with autoimmune thyroid diseases［J］.Autoimmunity，2012，45(7):533 -539.

［10］唐天萍，洪 宇，謝琰臣，等.補體C3 基因rs7951 位點多態性與重癥肌無力的相關性研究［J］.中風與神經疾病雜志，2013，30(4):320 -324.

［11］Iwakura Y，Ishigame H，Saijo S，et al.Functional specialization of interleukin-17 family members［J］.Immunity，2011，34(2):149-162.

［12］Mu L，Sun B，Kong Q，et al.Disequilibrium of T helper type 1，2 and 17 cells and regulatory T cells during the development of experimental autoimmune myasthenia gravis［J］.Immunology，2009，128(12):826-836.

［13］陸 珺，黃 瑩，盧家紅，等.重癥肌無力患者血清Th1/Th2/Th17 細胞因子的變化及意義［J］.中國臨床神經科學，2010，18(5):480 -484.

［14］Roche JC，Capablo JL，Larrad L，et al.Increased serum interleukin-17 levels in patients with myasthenia gravis［J］.Muscle Nerve，2011，44(2):278 -280.