星點設計-效應面法優化大黃煮散顆粒煎煮工藝

任虹，傅超美，任波，蔣燕萍，嚴鑫，趙思蕾

·炮制制劑·

星點設計-效應面法優化大黃煮散顆粒煎煮工藝

任虹，傅超美，任波，蔣燕萍，嚴鑫，趙思蕾

目的：優化大黃煮散顆粒煎煮工藝。方法：以加水量(倍)、浸泡時間和煎煮時間為考察對象，對總蒽醌煎出率和干膏收率進行歸一化處理后，以歸一化值為考察指標，分別進行多元線性回歸和二項式方程擬合，用星點設計-效應面法優化煎煮工藝并進行預測分析及驗證優選出大黃煮散顆粒最佳煎煮工藝。結果：二項式方程擬合度較高，復相關系數分為R=0.940，預測性較好；其優化工藝為取大黃煮散顆粒，加入16倍量水，浸泡14 min，煎煮兩次，每次34 min。結論：星點設計-效應面法優選大黃煮散顆粒煎煮工藝方法簡便可靠，具有良好的預測性，優選的煎煮工藝合理可行。

大黃煮散顆粒；星點設計；效應面優化法；煎煮工藝

大黃為蓼科植物掌葉大黃Rheum palmatum L.、唐古特大黃Rheum.tanguticum Maxim.ex Balf，或藥用大黃Rheum officinale Baill.的干燥根和根莖[1]。味苦、性寒。歸大腸、脾、胃、肝、心經。具有瀉下攻積、瀉火解毒、涼血止血、活血祛瘀和清泄濕熱的功效[2]。大黃主要有效成分為蒽醌類化合物，又分為游離型蒽醌和結合型蒽醌。為提高中藥飲片利用率，以節約藥材、節省時間為目的[3]，實驗將大黃傳統飲片開發成大黃煮散顆粒。中藥煮散顆粒是在傳統煮散基礎之上，結合現代先進科學技術，只改變外觀性狀，不加其它任何輔料制成的現代新型中藥飲片。作為對傳統飲片的一種改革嘗試，中藥煮散顆粒具有悠厚的歷史底蘊，是“古為今用、尊古厚今”的體現。由于煮散顆粒只改變了傳統飲片的物理性狀，其粒度的改變定將影響有效成分的浸出，并將為新型中藥飲片的形成奠定一定的基礎。

本課題組前期試驗已考察出陳皮、黃柏、干姜、黃連煮散顆粒在不同煎煮時間點煎出效率均高于傳統飲片[3～6]，在前期試驗的基礎上，為了考察出大黃最佳臨床煎煮工藝，本實驗選用星點設計-效應面法優化其煎煮工藝。此法常用于優化藥材和制劑提取工藝、處方篩選，該方法簡便、直觀，且預測值更接近真實值[7]。

1 儀器與試藥

LC-20A高效液相色譜儀（日本島津）；BP211D電子分析天平( 十萬分之一，德國Sartorius 公司)；BP121S 電子分析天平( 萬分之一，德國Sartorius 公司) ； 202-2 型干燥箱( 上海市實驗儀器總廠) ；粉碎機DJ靈巧型（上海淀久中藥機械制造有限公司）。

大黃藥材購于成都荷花池中藥材專業市場，經鑒定為藥用大黃Rheum officinale Baill.的干燥根和根莖。大黃素甲醚對照品（四川省維克奇生物技術有限公司，批號120902，純度≥98%），大黃素對照品（四川省維克奇生物技術有限公司，批號120210，純度≥98%），蘆薈大黃素對照品（四川省維克奇生物技術有限公司，批號120723，純度≥98%），大黃酸對照品（四川省維克奇生物技術有限公司，批號120115，純度≥98%），大黃酚對照品（四川省維克奇生物技術有限公司，批號120621，純度≥98%），甲醇(色譜純) ，水為蒸餾水，其他試劑均為分析純。

2 方法與結果

2.1 大黃煮散顆粒的制備

按前期研究結果，將大黃飲片進行粉碎，得細粉，加適量水混勻制得軟材，制成顆粒，干燥，整粒，即得。

2.2 干膏收率的測定

取大黃煮散顆粒約5 g，精密稱定，按照星點設計表1和表2進行試驗，取各試驗安排下的提取液續濾液定容至100 mL，精密移取50 mL于已干燥至恒重的蒸發皿中，水浴揮干，置烘箱于105 ℃干燥3 h，取出移置干燥器中，冷卻后精密稱定重量，結果見表2。

2.3 大黃游離型蒽醌的HPLC測定

參照《中國藥典》2010年版一部大黃藥材項下含量測定方法[1]和文獻[8～10]方法對各樣品中游離型蒽醌、結合型蒽醌和總蒽醌的含量進行測定。

2.3.1 色譜條件 色譜柱DiamonsilTMC18（5 μm，250 mm×4.6 mm）；流動相：甲醇-0.1%磷酸溶液（85：15）；檢測波長：254 nm；流速：1 mL﹒min-1；柱溫：30 ℃；理論塔板數按大黃素峰計算應不低于3000。

2.3.2 對照品溶液的制備 取各對照品適量，精密稱定，加甲醇制成每1 mL對照品含蘆薈大黃素、大黃酸、大黃酚、大黃素和大黃素甲醚分別為48 μg、279 μg、126 μg、39 μg、39 μg的標準溶液，備用。

2.3.3 供試品溶液的制備 取大黃煮散顆粒約5 g，精密稱定，按星點設計表1和表2進行試驗，取各試驗安排下的提取液續濾液定容至100 mL，用移液管取10 mL提取液續濾液于分液漏斗中，分別加入三次氯仿溶液，每次分別為20 mL、20 mL、10 mL氯仿，待分層后，收集氯仿層溶液，保留水層待用，揮干氯仿液后，用甲醇溶解并定容放置于10 mL容量瓶中，即得大黃煮散顆粒游離型蒽醌供試品溶液。

將上述水層溶液置于圓底燒瓶中，加入20 mL氯仿后，置75 ℃水浴鍋中水浴1 h，收集氯仿層；同法提取三次，每次氯仿液量分別為20 mL、20 mL、20 mL。收集三次氯仿液，揮干氯仿液后，用甲醇溶解并定容放置于10 mL容量瓶中，即得大黃煮散顆粒結合型蒽醌供試品溶液。

2.3.4 標準曲線的繪制 取“2.3.2”項下對照品溶液2，6，10，14，18 μL注入液相色譜儀，測定峰面積。以進樣量為橫坐標（X）、峰面積值為縱坐標（Y）繪制蘆薈大黃素、大黃酸、大黃酚、大黃素和大黃素甲醚的標準曲線。計算得到回歸方程分別為Y1=6849906.901X1+56791.0125 (R=0.9994), Y2=2674614.421X2-398549.3662 (R=0.9996), Y3=4221682.662X3-104266.6528 (R=0.9991), Y4=7520725.962X4+689412.525 R=0.9991, Y5=2127421.975X5+17573.10795 (R=0.9992)。五種對照品分別在96 -864 μg，560-5020 μg，252-2268 μg，78-702 μg，78-702 μg范圍內線性關系良好。

2.3.5 大黃煮散顆粒總蒽醌的測定 游離型蒽醌的測定：取“2.3.3”項下大黃煮散顆粒游離型蒽醌供試品溶液，參照“2.3.1”項下色譜條件，進行蘆薈大黃素、大黃酸、大黃酚、大黃素和大黃素甲醚的含量測定。將五種含量結果相加即得大黃煮散顆粒游離型蒽醌的含量。

結合型蒽醌的測定：方法同游離型蒽醌的測定。

總蒽醌=游離型蒽醌+結合型蒽醌。結果見表2。

2.4 星點設計試驗

試驗前，通過預試驗對大黃煮散顆粒煎煮效率各影響因素進行了初步的考察。分析結果后以加水量、浸泡時間、煎煮時間為考察因素，煎煮次數為非連續變量回歸處理較困難，結合預試驗結果和工業生產的實際，設定煎煮次數為2次，其余因素的水平據試驗結果而定。影響因素及水平見表1，試驗安排及結果見表2。

表1 影響因素及水平

表2 星點試驗設計及結果

2.5 模型擬合

用Design Expert 7.0統計軟件，以大黃煮散顆粒總蒽醌煎出率、干膏收率歸一值OD為因變量，對各自變量因素(A、B、C)進行多元線性回歸和二項式擬合，模型的好壞通過復相關系數進行判定。

多元線性模型擬合方程如下：

OD=-0.478+0.057-8.25150E-003B+0.0131C（R=0.50,P=0.1972）

二次多項式模型擬合方程如下：

OD=-15.97+1.496A+0.140B+0.243C-6.49E-003AB-8.78E-003AC+5.26E-003BC-0.0345A2-1.962E-003B2-1.770E-003C2（R=0.940,P=0.0012）

由以上分析可知，二次多項式模型復相關系數明顯高于多元線性方程復相關系數，說明該煎煮工藝各項指標采用二項式方程擬合更為恰當，故選擇二項式擬合方程優選工藝參數。

2.6 工藝參數優化和預測

因變量曲面圖是三維圖，只能表達兩個自變量的函數，因此固定三個自變量之一為中值，以擬合的目標函數為數學模型，應用Design Expert 7. 0 統計軟件繪制因變量三維圖及等高圖。見圖1-3。

圖1 加水量與浸泡時間對OD影響的三維圖和等高圖

圖2 加水量與煎煮時間對OD影響的三維圖和等高圖

圖3 浸泡時間與煎煮時間對OD影響的三維圖和等高圖

在歸一化處理后得到的OD值中以加水量和浸泡時間兩因素作圖可知，加水量16～18.31倍，浸泡時間6.34～17 min，以加水量和煎煮時間兩因素作圖可知，加水量16～18.31倍，煎煮時間20.28～34.72 min；以浸泡時間和煎煮時間兩因素作圖可知，浸泡時間6.34～19.33 min，煎煮時間23.89～34.72 min；綜合以上信息，加水量為16～18.31倍，浸泡時間6.34～15 min，煎煮時間23.89～34.72 min。結合實際生產情況和預試驗的結果，優選最佳工藝為：取規定量大黃煮散顆粒，加入16倍量水，浸泡14 min，煎煮兩次，每次34 min。

2.7 驗證試驗

對以上所得工藝進行驗證，結果見表3。

表3 驗證試驗（n=3）

大黃煮散顆粒煎煮工藝條件為：取大黃煮散顆粒，加入16倍量水，浸泡14 min，煎煮兩次，每次34min。

3 結論與討論

大黃為臨床常用瀉下藥之一，其有效成分為蒽醌類成分。在本試驗中以總蒽醌煎出率和干膏收率兩者總體歸一值為評價指標優化大黃煮散顆粒的煎煮工藝，試驗結果表明，采用星點設計-效應面優化法優選中藥煮散的煎煮工藝，考察因素的水平范圍更大，同時采用非線性數學模型擬合，復相關系數較高，可信度較好，方法簡便可靠，建立的數學模型具有良好的預測性，且預測值更接近真實值，優選的煎煮工藝合理可行。本試驗的結果可為煮散顆粒在臨床上的應用奠定基礎。

煮散顆粒粒度變小，煎煮溶媒與顆粒接觸面積增大，更利于滲入顆粒內部，將有效成分煎出。能更好的提高中藥飲片利用率，大大縮短煎煮時間，同時也能節約中藥飲片用量。但是，煮散顆粒若粉末粒度過細，不利于溶液的濾過操作，因此，在不影響煮散顆粒成型性的前提下，可根據具體中藥飲片需要選擇較大粒徑的粉末進行煮散顆粒的制備。

煮散顆粒能增大有效成分的溶出，但是同時也可能會增大有害成分的溶出。因此需要對其進行相關的藥效學對比研究，確定煮散顆粒的臨床用量。才能保證臨床上安全地使用煮散顆粒這一劑型。

[1] 國家藥典委員會.中國藥典(一部)[S].北京:中國醫藥科技出版社,2010: 22.

[2] 張廷模.臨床中藥學[M].上海:上海科學技術出版社,2012:136.

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[4] 林俊芝,傅超美,毛茜,等. 黃柏飲片與煮散顆粒在不同煎煮時間點鹽酸小檗堿含量和干膏收率的比較[J].中國實驗方劑學雜志,2012,18(12):41.

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（責任編輯：何瑤）

Optimization decoction process of Dahuang Zhusan Keli by central composite design - response surface method

REN Hong, FU Chao-mei, REN Bo, JIANG Yan-ping, YAN Xin, ZHAO Si-lei//( Pharmacy College, Chengdu University of Traditional Chinese Medicine; The Ministry of Education Key Laboratory of Standardization of Chinese Herbal Medicine; State Key Laboratory Breeding Base of Systematic Research, Development and Utilization of Chinese Medicine Resources Co-founded by Sichuan Province and MOST, Chengdu 611137, China)

Objective:To optimize the decoction process of Dahuang Zhusan Keli.Method:With the water addition (Times), immersion time and decocting time as the objects of study, the normalized values of the total Anthraquinone extraction rate and yield of dry extract were used as observing indexes. Multiple linear regression and quadratic-ft equation were used to estimate the relationship between independent and dependent variables to choose the optimization decoction process of Dahuang Zhusan Keli by central composite design - response surface method.Result:The results showed that the regression coeffcients of quadratic-ft equation were better for the estimation with R value of 0.940. The optimal conditions of decoction process were 16-fold solvent, 14 minutes soaked，2 times boiling and 34 minutes every time.Conclusion:The established model can well predict the extraction process. The optimized process is reliable for the dode.

Dahuang Zhusan Keli; central composite design; response surface methodology; decoction process

R 283

A

1674-926X(2014)03-004-04

四川省科技支撐計劃（310931）

成都中醫藥大學藥學院 中藥材標準化教育部重點實驗室中藥資源系統研究與開發利用省部共建國家重點實驗室培育基地，四川 成都 611137

任虹，女，在讀碩士研究生，從事中藥新制劑和新劑型的研究Tel:15882232829 Email:363568917@qq.com

任波，男，講師，主要從事中藥物質基礎及質量標準研究

2013-12-26