5-氮雜胞苷對石斛生物活性成分的影響

倪竹君，殷麗麗，應奇才，茹雅璐，王迪仙，金 琳，謝 軍，胡忠建，王慧中，徐祥彬

（杭州師范大學生命與環境科學學院，浙江杭州 310036）

5-氮雜胞苷對石斛生物活性成分的影響

倪竹君，殷麗麗，應奇才，茹雅璐，王迪仙，金 琳，謝 軍，胡忠建，王慧中，徐祥彬*

（杭州師范大學生命與環境科學學院，浙江杭州 310036）

本研究利用5-氮雜胞苷（5-azaC）處理石斛組培苗，分析石斛苗生長變化、生物活性物質含量及其相關基因表達變化。研究發現，石斛苗生物量和生物活性物質，如石斛多糖、石斛堿和胡蘿卜素，含量明顯升高，相關基因表達量也顯著上升，證實DNA去甲基化修飾對石斛次生代謝產物生物合成具有重要調控作用。

5-氮雜胞苷；DNA去甲基化修飾；石斛；生物活性成分

浙江省是中國最早實現石斛產業化的省份，是石斛類保健產品的生產基地和消費大省。目前，全省鐵皮石斛類藥品和保健食品的年銷售規模近10億元，拉動相關產業產值幾十億元，已形成集科研、種植、加工、銷售為一體的石斛產業。但與野生條件生長的石斛相比，目前人工栽培的石斛藥材活性成分含量較少，極大影響了石斛藥用，盡管有研究人員采用“仿野生栽培”方式培養，但仍不能從根本上解決石斛活性成分積累的問題。隨著DNA甲基化和去甲基化修飾在植物生長、發育和抗逆過程中的基因表達調控機理研究，以及在微生物活性成分積累上的大量研究應用，越來越多的證據表明，DNA甲基化和去甲基化修飾在調控藥用植物活性成分含量方面具有重要的應用前景。因此，篩選能夠調控石斛生物活性物質成分合成積累的DNA甲基酶抑制劑小分子，研發生物化學和分子生物學定向調控技術，提高石斛藥用和食用價值，對浙江省石斛產業發展具有重要的經濟意義和廣闊的市場前景。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

5-azaC（Sigma）先溶于10μL二甲基亞砜，后溶于水，配成10，20和50μmol·L-1溶液備用。

金釵石斛產自云南，無菌組培苗由其種子播種在N6培養基上分化，使用B5培養基進行繼代培養獲得。用20μmol·L-15-氮雜胞苷處理120d組培苗，然后置于溫室中分別培養0，60和90d，用天平測量生物量變化，并取液氮速凍，保存備用。

1.2 生物活性物質含量測定

1.2.1 可溶性多糖測定

稱取80℃烘干的石斛粉末0.5g，置于圓底燒瓶中，加入石油醚50mL，65℃回流提取1h，脫脂，過濾，揮干溶劑，加入80%乙醇50mL，回流提取1 h，過濾，揮干溶劑，加入蒸餾水20mL于80℃回流提取2h，趁熱過濾，取濾液滴在Pocket-Refractometer Pal-1型糖度計上測定可溶性多糖含量。

1.2.2 石斛堿測定

將金釵石斛于80℃烘干至恒重，粉碎后精密稱取0.5g，置100mL圓底燒瓶中，加2mL氨水潤濕30min后，加入氯仿50mL，稱重，65℃回流提取2 h，以氯仿補足失重，減壓回收溶劑至干，加甲醇超聲溶解，定量轉入2mL容量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，吸入注射器，0.45μm微孔濾膜過濾，注入進樣瓶。利用氣相色譜（GC）測定，毛細管柱，19091J-413HP-530.0m×320μm×0.25μm，氮氣載入，流速0.7mL·min-1，進樣口溫度250℃，柱溫以5℃·min-1的速度從120℃升至150℃（起始溫度點和終止溫度點均穩定15min），氫火焰離子化檢測器檢測，檢測器溫度為250℃。

1.3引物合成及實時熒光定量PCR（Real-Time PCR）

參照本實驗室EST測序結果，設計Actin引物：Forward：5’-AGGCTAACAGAGAGAAGA TG-3’和Reverse：5’-AGCAAGGTCAAGCCT CAGAAT-3’；托品酮還原酶基因（TRⅡ）：Reverse：5’-GGATAGGGTATGCCATTGTTG-3’和Reverse：5’-GCCATCTTTACCCCATTC AC-3’；3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A還原酶基因（HMGR）Forward：5’-TGCTTACAAAATGAC TTCCCTG-3’和Reverse：5’-CCCTTTACGCCA AGCAGAT-3’。

Real-TimePCR反應體系均為2×qPCRMix25 μL，PCR引物各25pmol，cDNA模板1μL（約200ng），Taq酶2U，加滅菌雙蒸水至50μL。反應步驟為：95℃預變性5min；95℃15s，52℃30s，循環40次。

2 結果與分析

2.1 可溶性多糖含量變化

由表1可知，5-azaC處理60和90d后，石斛可溶性多糖含量明顯上升，每克干重材料分別達到0.1311和0.1645g，分別是對照的1.1和1.2倍。說明5-azaC處理確實影響了多糖生物合成過程，提高了其含量。

表1 5-azaC處理后石斛多糖含量變化

2.2 石斛堿含量變化

5-azaC處理以后，石斛堿含量顯著上升。處理60和90d后，石斛堿含量在每克干重材料分別達到了0.1722和0.1764g，分別是對照的1.5和1.6倍，說明5-azaC處理影響了石斛堿生物合成過程。

表2 5-azaC處理后石斛堿含量變化

2.3 生物活性物質相關基因表達量變化

通過Real-TimePCR可知，5-azaC處理60和90d后，TRⅡ基因相對表達量顯著上升（圖1）。由于TRⅡ基因編碼生物堿合成酶托品酮還原酶，其表達量升高可提高生物堿生物合成量，這可能與5-azaC處理激活相關隱性基因表達有關。

圖1 TRⅡ基因相對表達量分析

由圖2可知，在5-azaC處理后，組培石斛苗HMGR基因相對表達量也顯著上升。處理60和90 d后，雖然對照石斛中該基因表達也有上調，但上調幅度不如5-azaC處理高。由于HMGR基因編碼3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A還原酶，是生物堿骨架結構生物合成的關鍵酶，因此該基因的表達對生物堿含量正調控具有重要作用。

圖2 HMGR基因相對表達量分析

3 小結與討論

作為表觀遺傳學一種主要機制，DNA甲基化和去甲基化修飾在植物生長、發育、開花、衰老及抗逆過程中扮演著重要的角色，是調節基因功能的重要手段。在相對穩定的基因組內，DNA甲基化能夠確?；蚪M的正常協調表達，一旦這種正常的DNA甲基化體系遭到破壞，就會出現異?；虮磉_現象，進而影響其表現［1-6］。在微生物中，DNA的去甲基化對于沉默基因的轉錄重激活也起著重要作用。已有研究發現，去甲基化可激活真菌部分沉默基因表達，調控次級代謝反應，從而提高活性物質合成。例如利用5-azaC能激活裂褶菌和粗糙脈胞菌中的潮霉素抗性基因，以及黃孢原毛平革菌中的腐草霉素抗性基因［7-8］。Mooibroek等［7］先后使用5種DNA甲基轉移酶抑制劑，分別對12種真菌進行表觀遺傳修飾，發現11種真菌次級代謝發生明顯變化，活性物質產量明顯提高，其中膠孢殼屬產生了2種新型糖基化聚酮化合物。說明DNA去甲基化修飾對微生物生物活性物質具有重要調控作用。

從試驗結果可知，5-azaC處理金釵石斛組培苗后，其多糖含量和生物堿含量明顯上升，編碼生物堿合成酶托品酮還原酶的TRⅡ基因和編碼3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A還原酶HMGR基因相對表達量均顯著上調，說明5-azaC去甲基化修飾處理可能激活了這些生物堿合成相關基因表達，從而提高石斛藥用價值。由于石斛遺傳背景還不清楚，沒有相關基因組數據庫信息，目前還不能進一步驗證5-azaC處理對石斛基因組去甲基化修飾的具體位點，但通過本研究及微生物研究已有結果可知，DNA去甲基化修飾對提高石斛藥用價值具有很大的潛在應用性。因此進一步篩選能夠調控石斛生物活性物質成分合成積累的DNA甲基酶抑制劑小分子，研發生物化學和分子生物學定向調控技術，對提高石斛藥用和食用價值，促進浙江省石斛產業發展和農民增收具有重要意義。

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（責任編輯：張瑞麟）

S432.2文獻標志碼：A文章編號：0528-9017（2014）07-1018-03

文獻著錄格式：倪竹君，殷麗麗，應奇才，等.5-氮雜胞苷對石斛生物活性成分的影響［J］.浙江農業科學，2014（7）：1018-1020.

2014-04-10

杭州市科技發展計劃項目（20120232B11）

倪竹君（1991-），女，生命與環境科學學院本科生。E-mail：441845349@qq.com。

徐祥彬（1977-），男，副教授，博士，從事植物表觀遺傳學研究工作。E-mail：xbxuibcas@126.com。