結球白菜轉錄因子基因BrCCCH的克隆與分析

王 嵐，金建峰，蔣 明，趙羅鵬，田 星，樓瀟瀟

（臺州學院生命科學學院，浙江椒江 318000）

結球白菜轉錄因子基因BrCCCH的克隆與分析

王 嵐，金建峰，蔣 明*，趙羅鵬，田 星，樓瀟瀟

（臺州學院生命科學學院，浙江椒江 318000）

CCCH型鋅指蛋白是1種轉錄因子，在植物生長、發育和逆境反應中起著重要的調控作用。本研究以結球白菜葉片為材料，利用PCR技術克隆到1個CCCH基因。結果表明，BrCCCH的基因組全長為2302bp，具6個內含子，編碼450個氨基酸，BrCCCH編碼蛋白有5個保守的C-X8-C-X5-C-X3-H基序；序列比對結果表明，BrCCCH與13種植物CCCH基因的相似性為45%～97%，與同屬植物蕪菁的相似性最大，與禾本科的烏拉爾圖小麥的相似性最小；從進化樹上看，不同科的植物各自聚為1組，支持率達100%。BrCCCH基因的克隆為后續開展其表達分析和基因功能鑒定奠定了基礎。

結球白菜；CCCH；基因克隆；轉錄因子

轉錄因子（transcriptionfactor）是1類調控因子，能與順式作用元件特異結合以控制基因的表達，在植物生長發育和對環境的響應過程中起著重要作用［1］。轉錄因子的種類繁多，通常以基因家族形式存在，如MYB，WRKY，NAC，HLH，bZIP，ERF和鋅指蛋白（Zincfinger，ZF）等。根據結構域中半胱氨酸（Cys）及組氨酸（His）的數量與位置，ZF可分為C2H2，C2C2，C2HC，C2C2C2C2、C2HCC2C2，C2HC5和CCCH等多個亞類［2］。其中的CCCH因蛋白質序列中含保守的1～6個C-X4-15-C-X4-6-C-X3-H基序而得名，該結構域富含甘氨酸和苯丙氨酸殘基［3］。CCCH能與DNA直接結合，也可與RNA相互作用，在植物生長、發育、生物及非生物脅迫過程中起著重要的調控作用。本研究以結球白菜（Brassicarapavar. pekinensis）為材料，利用PCR方法克隆1個CCCH鋅指結構基因，并利用生物信息學手段進行分析，為后續的基因表達和功能鑒定奠定基礎。

1 材料和方法

1.1 材料

結球白菜材料為自交系09-22，由實驗室栽培。于3葉1心期采集葉片，置于低溫箱中保存備用。同源蛋白序列下載自NCBI，分別是擬南芥（Arabidopsisthaliana）（登錄號：AEE74389.1）、蕪菁（Brassicarapa）（ADK63414.1）、山萮菜屬植物（Eutremasalsugineum）（ESQ49402.1）、薺菜（Capsellarubella）（EOA30545.1）、野草莓（Fragaria vesca）（XP_004296815.1）、桃（Prunuspersica）（EMJ24004.1）、番茄（Solanumlycopersicum）（XP_ 004229205.1）、馬鈴薯（Solanumtuberosum）（XP_ 006342757.1）、玉米（Zeamays）（DAA54000.1）、二穗短柄草（Brachypodiumdistachyon）（XP_ 003566545.1）、短花藥野生稻（Oryzabrachyantha）（XP_006644012.1）、大麥（Hordeumvulgare）（BAJ92501.1）和烏拉爾圖小麥（Triticumurartu）（EMS67785.1）。

1.2 DNA、RNA提取和cDNA合成

基因組DNA的提取采用SDS法，RNA的提取采用TRIzol法，cDNA合成利用SMARTTMPCR cDNASynthesisKit試劑盒。

1.3 基因克隆

根據NCBI已知的CCCH基因序列設計PCR引物，分別是BrC3HUP：5′-ATGGAGCGGTACGGTC-3′和BrC3HDN：5′-TTAACTTGAAGAAGTCTTAGC-3′。分別以葉片DNA和cDNA為模板進行PCR擴增，在20μL反應體系中，加入2μL10×PCR緩沖液，1.5U的TaqDNAplus酶（北京鼎國），0.4μL的dNTPs（上海生工），各0.5μL上、下游引物（20μmol·L-1），40ng各模板。PCR擴增程序為：94℃預變性5min；94℃變性45s，51℃退火60s，72℃延伸120s，32個循環。

1.4 生物信息學分析

Scanprosite在線工具http：//prosite.expasy. org/scanprosite/用于保守基序的檢索；ClustalX 1.81軟件用來對齊序列；Mega3.1軟件用于構建進化樹，方法為鄰接法，自舉檢測次數為1000。

2 結果與分析

2.1 BrCCCH基因的序列特征

分別以結球白菜葉片DNA和cDNA為模板進行PCR擴增，克隆到相應的序列。結果表明，BrCCCH的基因組DNA全長為2302bp，具6個內含子，長度依次為71，76，86，95，541和80bp，其中第5內含子最長；BrCCCH的編碼區長度為1353bp，由7個外顯子拼接而成，這些外顯子的長度為72～333bp，第7外顯子最長，第3外顯子最短（圖1）。

圖1 結球白菜BrCCCH基因的結構（方塊表示外顯子，細線表示內含子）

2.2 BrCCCH編碼蛋白的特征

BrCCCH基因編碼450個氨基酸，經http：// prosite.expasy.org/scanprosite/檢索發現，該蛋白具5個CCCH基序，依次為RSNEPDCIYYLRtGVCG YGSRCRFNHPRD、RMGQPVCQHFMRtGTCKYGGSC KYHHPRQ、RPGEKECSYYMRtGQCKFGLTCRFNHP VP、RPDQPECQYFMRtGDCKFGASCRYHHPLD和RPGTAQCTHFAQhGICKFGPACKFDHSMA（圖2），分別位于48-76，96-124，142-170，293-321和339-367殘基位置（圖3），這5個CCCH基序可用通式C-X8-C-X5-C-X3-H表示。

圖2 結球白菜BrCCCH基因的編碼區全長序列及其推導的氨基酸序列

圖3 結球白菜BrCCCH編碼蛋白的保守基序及位置

2.3 BrCCCH與同源序列的比對和進化分析

利用ClustalX1.81軟件對齊不同植物的CCCH編碼蛋白序列，比對結果表明，BrCCCH與其余13種植物的相似性為45%～97%，其中與蕪菁的相似性最高，與山萮菜屬植物E.salsugineum次之，與禾本科植物CCCH的相似性最低（圖4）。從進化樹上看，BrCCCH與同科的擬南芥、山萮菜、蕪菁和薺菜聚為1組，支持率達100%；薔薇科的野草莓和桃聚為1組，茄科的番茄與馬鈴薯聚為一組，而禾本科的玉米、二穗短柄草、短花藥野生稻、大麥和烏拉爾圖小麥另成1組，支持率均達到100%（圖5）。

圖4 BrCCCH與其他植物CCCH序列的比對

3 小結和討論

CCCH轉錄因子廣泛分布于動物、植物和微生物中，以基因家族的形式存在［4-5］。近年來，已分別從陸地棉（Gossypiumhirsutum）、水稻、黃瓜（Cucumissativus）和小麥（Triticumaestivum）等作物中克隆到CCCH基因，它們在作物不同的發育階段和不同的逆境條件下表達［6-10］。陸地棉GhZFP1基因全長1377bp，編碼區全長1020bp，編碼339個氨基酸，具C-X8-C-X5-C-X3-H和C-X5-C-X4-C-X3-H保守基序；水稻OsTZF1基因編碼區全長1209bp，編碼402個氨基酸，有2個C-X5-H-X4-C-X3-H和1個C-X7-C-X5-C-X3-H保守基序，及1個C-X5-C-X4-C-X3-H保守基序；黃瓜CsSEF1基因的編碼區全長924bp，編碼307個氨基酸；小麥TaZnFP基因的編碼區全長為1533bp，編碼510個氨基酸，具C-X5-C-X4-C-X3-H和C-X9-C-X4-CX3-H這2個保守基序。

本研究從結球甘藍中克隆到1個CCCH基因，該基因的編碼區全長為1353bp，較陸地棉GhZFP1和黃瓜CsSEF1的編碼區長，但短于水稻的OsTZF1和小麥的TaZNFP基因。BrCCCH的保守基序數量較多，但均為同種類型，即C-X8-C-X5-C-X3-H，與13種植物CCCH的相似性為45%～97%，進化分析結果表明，不同科的植物各自聚為1組，支持率達100%。結球白菜BrCCCH基因的克隆，為后續開展其表達分析和功能鑒定奠定了基礎。

圖5 用鄰接法構建的CCCH系統發生樹

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（責任編輯：高 峻）

Q78文獻標志碼：A文章編號：0528-9017（2014）07-1040-04

文獻著錄格式：王嵐，金建峰，蔣明，等.結球白菜轉錄子基因BrCCCH的克隆與分析［J］.浙江農業科學，2014（7）：1040-1043.

2014-03-14

浙江省自然科學基金項目（LY13C150003）；浙江省本科院校中青年學科帶頭人學術攀登項目（pd2013420）；臺州學院校立學生科研項目（No.13XS24）

王 嵐（1992-），女，浙江天臺人，本科生，從事植物分子生物學研究工作。

蔣 明。E-mail：jiangming1973@139.com。