正交試驗法優選痛風顆粒醇提工藝

陳梓賢，李建利，2，羅悅，王利潔

·炮制制劑·

正交試驗法優選痛風顆粒醇提工藝

陳梓賢1，李建利1，2，羅悅1，王利潔1

目的：優選痛風顆粒的醇提取工藝。方法：采用L9（34）正交試驗優選提取工藝條件，以蒼術素，鹽酸小檗堿和干膏收率的綜合評分為指標，考察乙醇用量，乙醇濃度、提取次數和提取時間對醇提工藝條件的影響。結果：最佳提取工藝為加6倍量60%的乙醇，提取3次，每次0.5小時。結論：優選所得提取工藝條件穩定可行，適用于痛風顆粒的工業化生產。

痛風顆粒；醇提工藝；正交設計

蒼術為菊科植物茅蒼術Atractylodes lancea(Thunb.) DC.或北蒼術Atractylodes chinensis(DC.)Koidz.的干燥根莖，具有燥濕健脾，祛風散寒、明目的功效，其化學成分有蒼術素、蒼術酮等，且含量相對較高[1]。關黃柏為蕓香科植物黃檗Phellodndron amurense Rupr.的干燥樹皮，具有清熱燥濕，瀉火除蒸，解毒療瘡的作用，其主要含小檗堿類生物堿[2]。川牛膝為莧科植物川牛膝Cyathula offcinalis Kuan.的干燥根，具有逐瘀通經，通利關節，利尿通淋的功能，植物甾酮類成分為川牛膝中的主要有效組分[3]。

痛風顆粒為四川省中醫藥科學院中醫研究所承擔研發的第六類新藥，由金銀花、板藍根、蒼術、川牛膝、關黃柏等13味中藥組成，具有清熱解毒，祛風止痛，燥濕健脾之功效，主要用于痛風痹痛證的治療。復方中蒼術，關黃柏和川牛膝均含有較多的脂溶性成分，與其清熱祛風，燥濕健脾的功能關系密切。本試驗根據藥物的性質，采用正交試驗設計優選提取工藝，采用高效液相色譜法測定提取工藝中指標性成分蒼術素和鹽酸小檗堿的含量，以蒼術素含量、鹽酸小檗堿含量及干膏收率為考察對象進行綜合評分，確定痛風顆粒最佳提取工藝條件，從而為痛風顆粒的成型工藝研究提供試驗依據。

1 材料與儀器

1.1 儀器

Agilent1100高效液相色譜儀（儀器包括：Agilent色譜工作站、VMD紫外檢查器，美國安捷倫公司）；DJ600-2型電子天平（成都倍塞克儀器表研究所）；電熱套（北京中興偉業儀器有限公司）；GHG-9140A型電熱恒溫鼓風干燥箱（上海齊欣科學儀器有限公司）。

1.2 材料

關黃柏飲片、川牛膝飲片、蒼術飲片均購于四川省中藥飲片有限責任公司，并經成都中醫藥大學中藥鑒定教研室盧先明教授鑒定，蒼術為菊科植物茅蒼術Atractylodes lancea(Thunb.)DC.或北蒼術Atractylodes chinensis(DC.)Koidz.的干燥根莖，關黃柏為蕓香科植物黃檗Phellodndron amurense Rupr.的干燥樹皮，川牛膝為莧科植物川牛膝Cyathula offcinalis Kuan.的干燥根，均符合《中國藥典》2010年版一部及《四川省中藥飲片炮制規范》2002年版相關項下規定。蒼術素對照品（購于中國藥品生物制品檢定所，批號：111924-201102，供含量測定用）；鹽酸小檗堿對照品（購于中國藥品生物制品檢定所，批號：110713-200911，供含量測定用）；甲醇、乙腈為色譜純，水為超純水，其余試劑均為分析純。

2 方法與結果

2.1 正交試驗設計

根據預實驗結果，對影響該工藝的主要因素：加醇量，加醇濃度，提取次數，提取時間，用L9（34）正交試驗表進行優選。以鹽酸小檗堿、蒼術素、干膏收率為考察指標；各指標的權重評分為，干膏收率占20分，鹽酸小檗堿占40分，蒼術素占40分，總分為100分。因素與水平見表1。

表1 正交試驗因素水平表

2.2 干膏收率的測定

精密吸取按正交試驗表試驗得到的各份藥材醇提液20mL于已干燥至恒重的蒸發皿中，水浴蒸干后移至干燥箱105℃干燥3h，取出，移至干燥器中，冷卻30分鐘，迅速稱重，計算干膏收率。

2.3 蒼術素含量測定

2.3.1 色譜條件 色譜柱：Global Chromatography SP-120-5-C18-BI0（4.6×250mm），5μm；流動相：甲醇-水（80:20）；流速：1mL/min；進樣量：10μL；柱溫：30℃；檢測波長：340 nm；理論塔板數按蒼術素峰計算不低于5000。見圖1。

圖1 陰性對照（A）、蒼術素對照品（B）、供試品（C）的HPLC色譜圖

2.3.2 對照品與供試品溶液的制備 取蒼術素對照品適量，精密稱定，置棕色瓶中，加甲醇制成0.02136 mg．mL-1的溶液，即得對照品溶液。

稱取痛風顆粒處方各味藥材，共22g，平行9份，依次按照正交試驗表中確定的試驗條件操作，將所得藥液濾過，濾液定容至250mL瓶中，將濾液用微孔濾膜濾過即得供試品溶液。

2.3.3 陰性對照溶液的制備 處方比例，取除蒼術以外的其他味藥，按“2.3.2”供試品溶液制備方法制備陰性對照溶液。

2.3.4 線性考察 分別精密吸取上述蒼術素對照品溶液，分別進樣2μL、4μL、6μL、8μL、10μL、20μL，測定其峰面積。以對照品進樣量X(μg)為橫坐標，峰面積值Y為縱坐標，繪制標準曲線，得回歸方程為：Y=11584.996X－7.581，r=0.9999。結果表明蒼術素進樣量在0.0427～0.4272mg?mL-1范圍內，與峰面積線性關系良好。

2.3.5 精密度試驗 精密稱取上述蒼術素對照品溶液10μL，連續進樣6次，依法測定，結果蒼術素峰面積的RSD值為0.98%，表明該儀器精密度良好。

2.3.6 穩定性試驗 取上述蒼術素對照品溶液和“2.3.2”項下正交試驗 2號樣品貯備液制成的供試品溶液，分別在0h、6h、12h、16h、24h、48h進樣10μL，測定蒼術素的峰面積。結果對照品溶液蒼術素峰面積RSD值為0.75%（n=6），供試品溶液中蒼術素峰面積RSD值為0.83%（n=6），表明對照品溶液和供試品溶液在48h內基本穩定。

2.3.7 重復性試驗 取“2.3.2”項下2號樣品貯備液，按供試品溶液的制備方法，制備5份供試品溶液，分別進樣10μL，依法測定，結果蒼術素峰面積RSD值為0.63%，表明該方法重現性良好。

2.3.8 加樣回收率試驗 精密量取已知含量的樣品溶液1mL（0.1737mg．mL-1），共6份，按《中國藥典》2010年版一部附錄XVIIIA項下方法，計算加入等量蒼術素對照品溶液，按上述色譜條件下測定，計算蒼術素的加樣回收率。結果平均回收率99.84%，RSD值為1.72%（n=6），表明本品回收率符合要求。

2.3.9 樣品測定 取供試品溶液各10μL，注入液相色譜儀，測定，即得。

2.4 鹽酸小檗堿含量測定

2.4.1 色譜條件 色譜柱：Global Chromatography SP-120-5-C18-BI0（4.6×250mm），5μm；流動相：乙腈（A）-0.1%磷酸溶液（B），梯度洗脫（0～20min，73%A；20～25min，40%A；25～35min，10%A；35～40min，90%A；40～45min，73%A）；流速：1mL/min；進樣量：10μL；柱溫：30℃；檢測波長：345 nm；理論塔板數按鹽酸小檗堿峰計算不低于4000。見圖2。

圖2 陰性對照（A）、鹽酸小檗堿對照品（B）、供試品（C）的HPLC色譜圖

2.4.2 對照品與供試品溶液的制備 鹽酸小檗堿對照品適量，精密稱定，置棕色瓶中，加60%乙醇制成0.0576 mg．mL-1的溶液，即得對照品溶液。

稱取痛風顆粒處方各味藥材，共22g，平行9份，依次按照正交試驗表中確定的試驗條件操作，將所得藥液濾過，濾液定容至250ml瓶中，將濾液用微孔濾膜濾過即得供試品溶液。

2.4.3 陰性對照溶液的制備 按處方比例，取除關黃柏以外的其他味藥，按“2.4.2”供試品制備方法制備陰性對照溶液。

2.4.4 線性考察 分別精密吸取上述鹽酸小檗堿對照品溶液，分別進樣2μL、4μL、6μL、8μL、10μL、20μL，測定其峰面積。以對照品進樣量X(μg)為橫坐標，峰面積值Y為縱坐標，繪制標準曲線，得回歸方程為：Y=3870.462X－14.693，r=0.9998。結果表明鹽酸小檗堿的進樣量在0.0115～0.1152mg．mL-1范圍內，與峰面積線性關系良好。

2.4.5 精密度試驗 精密稱取上述鹽酸小檗堿對照品溶液10μL，連續進樣6次，依法測定，結果鹽酸小檗堿峰面積的RSD值為0.93%，表明該儀器精密度良好。

2.4.6 穩定性試驗 取上述鹽酸小檗堿對照品溶液和“2.4.2”項下正交試驗2號樣品貯備液制成的供試品溶液，分別在0h、6h、12h、16h、24h、48h進樣10μL，測定鹽酸小檗堿的峰面積。結果對照品溶液鹽酸小檗堿峰面積RSD值為0.62%（n=6），供試品溶液中鹽酸小檗堿峰面積RSD值為0.71%（n=6），表明對照品溶液和供試品溶液在48h內基本穩定。

2.4.7 重復性試驗 取“2.4.2”項下2號樣品貯備液，按供試品溶液的制備方法，制備5份供試品溶液，分別進樣10μL，依法測定，結果鹽酸小檗堿峰面積RSD值為1.06%，表明該方法重現性良好。

2.4.8 加樣回收率試驗 精密量取已知含量的樣品溶液1mL（0.0151 mg．mL-1），共6份，按《中國藥典》2010年版一部附錄XVIIIA項下方法，計算加入等量鹽酸小檗堿對照品溶液，按上述色譜條件下測定，計算鹽酸小檗堿的加樣回收率。結果平均回收率99.91%，RSD值為1.38%（n=6），表明本品回收率符合要求。

2.4.9 樣品測定 取供試品溶液各10μL，注入液相色譜儀，測定，即得。

2.5 試驗結果

依次測定每組蒼術素及鹽酸小檗堿含量，干膏收率，試驗結果和結果分析見表2、表3。

表2 正交試驗結果

表3 方差分析表

結果表明：根據綜合評分結果，由直觀分析可得影響提取效果的因素大小為：提取次數（C）＞乙醇濃度（B）＞乙醇用量（A）＞提取時間（D）；對實驗數據進行方差分析結果表明，提取次數對蒼術素、鹽酸小檗堿量及干膏收率有顯著性影響，乙醇濃度、乙醇用量和提取時間對蒼術素、鹽酸小檗堿量及干膏收率無顯著性影響。綜合直觀分析和方差分析結果，結合工業化大生產節約能效，降低生產成本考慮，確定最佳提取工藝為A1B2C3D1，即加6倍量60%乙醇，提取3次，每次0.5小時。

2.6 驗證試驗

按正交試驗篩選出的最佳提取工藝，重復試驗3次，結果蒼術素平均含量為3.249mg．g-1，鹽酸小檗堿平均含量為4.066 mg．g-1，干膏平均收率為30.06%。三者的RSD值依次為0.96%，0.82%，0.69%，表明所確定的最佳工藝穩定，合理可行。

3 討論

3.1 指標性成分的選擇

本試驗在確定提取工藝的評價指標時，復方中蒼術與關黃柏共為臣藥，蒼術素為主要且含量較多的有效成分，具有防止胃損傷、抗炎、利膽等作用[4]，所以作為評價指標之一，但其性質不穩定，遇光、熱，易氧化分解[5]，定量分析會產生波動，故同時選擇了關黃柏中主要有效成分鹽酸小檗堿[6]作為指標。

3.2 提取溶劑的選擇

本復方由13味藥材組成，化學成分復雜，采用傳統的提取工藝可能不能發揮其最好的臨床療效，故綜合考慮藥效與化學成分的性質，針對復方中蒼術、關黃柏、川牛膝3味藥材水溶性差的有效成分，故采用乙醇提取優選提取工藝。復方中其余10味藥材其中的水溶性有效成分相對較多，因此選擇水煎煮的提取工藝進行優選。

3.3 流動相的選擇

在測定蒼術素含量的過程中，試驗分別比較了甲醇-水（79:21）和甲醇-水（80:20）兩種不同的流動相，結果甲醇-水（80:20）效果較好，故選為流動相。

在測定鹽酸小檗堿含量時，試驗分別比較了乙腈-0.1%磷酸溶液，梯度洗脫（0～20min,25%;20～40 min,25%～65%A;40～45min,65%～90%A;45min～50min, 90%A;50～65min,25%A）和乙腈-0.1%磷酸溶液，梯度洗脫（0～20min,73%A;20～25min,40%A;35～40min,9 0%A;40～45min,73%A），結果后者的效果更好，故選為流動相。

[1] 石書江,秦臻,孔松芝,等.蒼術抗流感病毒有效成分的篩選[J].時珍國醫國藥,2012,23(3):565.

[2] 張冠英,董瑞娟,廉蓮.川黃柏、關黃柏的化學成分及藥理活性研究進展[J].沈陽藥科大學學報,2012,29(10):812.

[3] 譚玉柱,陳寶華,李敏,等.川牛膝不同變種的品質評價[J].中成藥,2012,34(9):1770.

[4] 周軍,趙晨,王杰.藿香正氣不同制劑中蒼術素的含量測定[J].藥物分析雜志,2012,32(8):1476.

[5] 張曉蘭,李錦,李遇伯,等.高效液相色譜法測定茅蒼術藥材中β-桉葉醇與蒼術素的含量[J].藥物分析雜志,2009,29(12):2051.

[6] 喻志芳,孫璇.復方黃柏滴丸中關黃柏提取工藝研究[J].新疆中醫藥,2012,30(3):72.

（責任編輯： 胡慧玲）

Optimization of alcohol extraction technology of Tongfeng granules by orthogonal test

CHEN Zi-xian1, LI Jian-li1,2, LUO Yue1, WANG Li-jie1//(1.Pharmacy College, Chengdu University of Traditional Chinese Medicine, Chengdu, 611137, China; 2.Institute of Traditional Chinese Medicine, Sichuan Academy of Chinese Medicine Sciences, Chengdu, 610031, China)

Objective:To optimize the alcohol extraction condition of Tongfeng granules.Method:The optimum conditions were investigated by the L9(34) orthogonal design. With the content of atractylodin, berberine hydrochloride and yield of dry extract as indexes, orthogonal design was taken to investigate effects of the concentration of alcohol, the amount of alcohol, extraction time and times on extraction technology.Result:The optimal conditions were as following: refux extracted 3 times with 6 folds of 60% ethanol for 0.5 hours each time.Conclusion:This optimized process is stable and feasible, and it can be applied in industrial production.

Tongfeng granule; alcohol extraction technology; orthogonal design

R 283

A

1674-926X(2014)05-006-04

1.成都中醫藥大學藥學院，四川 成都 611137；2.四川省中醫藥科學院中醫研究所，四川 成都610031

陳梓賢（1990-），男，碩士研究生，主要從事中藥新制劑、新劑型與新技術研究Tel:13458569717 Email:czxbangbang@163.com

李建利（1957-），男，教授，主任藥師，碩士研究生導師，主要從事中藥新制劑、新劑型與新技術研究Tel:15902833306 Email:menguan1005@163.com

2014-01-14