“二神丸”中藥物炮制前后對脾腎陽虛泄瀉大鼠血清中一氧化氮和胃動素、胃泌素的影響

潘新，胡昌江，耿媛媛，趙玲，熊瑞，陳志敏

·藥理毒理·

“二神丸”中藥物炮制前后對脾腎陽虛泄瀉大鼠血清中一氧化氮和胃動素、胃泌素的影響

潘新，胡昌江，耿媛媛，趙玲，熊瑞，陳志敏

目的：比較“二神丸”中兩味藥物炮制前后對脾腎陽虛泄瀉模型大鼠血清中一氧化氮（NO）、胃動素（MTL）、胃泌素(GAS)含量的影響，擬闡明“二神丸”中藥物炮制增強療效作用機理。方法：將50只SD雄性大鼠隨機分為正常、模型、陽性藥物、生品“二神丸”、炮制品“二神丸”5組，通過復合因素造脾腎陽虛泄瀉模型，并給藥后取血清，用酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）測定大鼠血清中一氧化氮、胃動素、胃泌素的水平。結(jié)果：模型組血清中一氧化氮、胃動素、胃泌素水平與正常組相比均有顯著增高（P＜0.05）；三個給藥組均能調(diào)節(jié)三者趨于正常水平，且炮制品“二神丸”組對一氧化氮、胃動素和胃泌素的調(diào)節(jié)作用比生品“二神丸”組更明顯（P＜0.05～0.01）。結(jié)論：“二神丸”中的藥物炮制后對大鼠血清中一氧化氮、胃動素和胃泌素的調(diào)節(jié)作用比生品“二神丸”組更為明顯，提示復方“二神丸”中藥物炮制后增強止瀉作用可能是通過糾正異常的一氧化氮水平和消化道激素而達到的。

二神丸；炮制；一氧化氮；胃動素；胃泌素

“二神丸”出自宋?許叔微的《普濟本事方》，是臨床治療五更瀉的經(jīng)典古方，五更瀉的主要病機為脾腎陽虛所致的腹痛泄瀉。該方由補骨脂、肉豆蔻兩味藥組成，其中補骨脂辛苦大溫，為君藥，溫腎暖脾；肉豆蔻辛溫，為臣藥，澀腸止瀉。我們在前期研究中證明方中補骨脂鹽炙，肉豆蔻煨炙，可增強固腸止瀉作用，但其增強療效的機理尚不明確。故本文從致痛物質(zhì)一氧化氮（NO）及消化道激素胃動素（MTL）、胃泌素(GAS)在脾腎陽虛泄瀉大鼠血清中的變化水平，來研究“二神丸”中藥物炮制后增強固腸止瀉的作用機理。

1 實驗材料

1.1 實驗動物及場地

清潔級SD大鼠，雄性，體質(zhì)量200～220 g，由四川達碩動物實驗中心提供。實驗動物生產(chǎn)許可證號：SCXK（川）2008-24。國家中醫(yī)藥管理局中藥藥理三級科研實驗室（NO：TCM-03-043）。

1.2 實驗儀器及試劑

352型芬蘭（Labsystems Multiskan MS）酶標儀，AC8型芬蘭（Thermo Labsystems）洗板機，TG16W型微量高速離心機（國產(chǎn)），GNP-9080 型隔水式恒溫培養(yǎng)箱（國產(chǎn)）；一氧化氮（NO）試劑盒（南京建成生物工程研究所，批號：20130325）；大鼠胃動素(MTL) ELISA試劑盒，美國RB（成都光海科技有限公司提供，批號:201310-X96），大鼠胃泌素(GAS) ELISA試劑盒，美國RB（成都光海科技有限公司提供，批號:201310-X96）。

1.3 造模、治療藥物

腺嘌呤混懸液：成都貝斯特試劑有限公司，批號D110160，臨用前用蒸餾水配置成濃度為200 mg．mL-1混懸液。

番瀉葉：購于成都市藥材市場，加水煮沸約10 min后用二層紗布過濾，濾液減壓濃縮成1.0 g．mL-1的藥液。

陽性藥物：選用健脾益氣的參苓白術(shù)丸（山東方健制藥有限公司，產(chǎn)品批號20120515），用前粉碎過100目篩，用蒸餾水配置成0.2 g．mL-1的混懸液。

生品“二神丸”和炮制品“二神丸”藥液：“二神丸”中補骨脂和肉豆蔻的量按《中藥大辭典（方劑分冊）》中的2:1比例配比，即生補骨脂：生肉豆蔻（100 g: 50 g）；炮炙后同等劑量，粉碎成粗粉，醇水雙提后濃縮配制成濃度0.35 g．mL-1藥液。補骨脂和肉豆蔻的來源和炮制方法如下：補骨脂和肉豆蔻均購于成都市藥材市場，經(jīng)成都中醫(yī)藥大學藥學院生藥教研室盧先明教授鑒定，分別為豆科植物補骨脂Psoralea corylifolia L.的干燥成熟果實和肉豆蔻科植物肉豆蔻Myristica fragrans Houtt.的干燥種仁。

補骨脂鹽炙品[1]：取補骨脂藥材，加入藥材量一半的食鹽水（濃度為0.02 g．mL-1），室溫悶潤24 h，于150℃炒制10 min后置托盤中于30℃鼓風烘箱中烘干。

肉豆蔻煨炙品[2]：取肉豆蔻生品與麥麩（100 g:40 g）同置鍋內(nèi)，文火加熱，溫度控制在130～150℃，翻炒20 min，至麥麩呈焦黃色，肉豆蔻呈棕褐色。

2 方法[3～5]

將50只SD雄性大鼠隨機分為正常、模型、陽性藥物、生品“二神丸”、炮制品“二神丸”等5組，除正常組外，其余各組大鼠按以下方法造模：①腺嘌呤200 mg．kg-1劑量灌胃4周致腎陽虛；②單日、雙日交替喂飼甘藍（10 g/只）和精煉豬油（2 mL/只）致飲食失節(jié)，附以每日下午游泳致勞倦過度達到傷脾氣目的；第3周開始，在之前造模基礎(chǔ)上再通過給予灌服冰番瀉葉（1 mL/100 g體重）2周達到傷脾陽的目的。從造模第4周開始，陽性組按參苓白術(shù)丸2.0 g．kg-1劑量，生“二神丸”、炮制“二神丸”組均按3.5 g．kg-1劑量(給藥劑量換算依據(jù)附正文后)，連續(xù)灌胃給藥2周。

實驗6周后，于大鼠眼眶后靜脈叢取血2 mL，靜置30 min后，3000 r．min-1離心10 min，取上層血清，4℃保存待測。

3 實驗結(jié)果

按一氧化氮（NO）測試盒說明書和胃動素（MTL）、胃泌素(GAS)酶聯(lián)免疫檢測試劑盒說明書操作，分別在酶標儀550 nm和450 nm波長下讀測量各孔的吸光度（OD值），計算結(jié)果見表1。

表 1 對脾腎陽虛泄瀉模型大鼠NO、MTL、GAS的影響（, n=10）

表 1 對脾腎陽虛泄瀉模型大鼠NO、MTL、GAS的影響（, n=10）

注：與正常組比較，▲P＜0.05，▲▲ P＜0.01；與模型組比較，*P＜0.05, ** P＜0.01；與生品“二神丸”組比較，#P＜0.05，##表示P＜0.01

組別 劑量(g．kg-1) NO(μmol．L-1) MTL(ng．L-1) GAS(ng．L-1)正常組 - 7.93±6.49 189.30±29.29 131.78±15.11模型組 - 12.83±1.82▲▲243.06±28.14▲▲261.14±24.44▲▲陽性藥物組 2.0 8.52±1.20**196.37±30.73**188.89±31.39**生品“二神丸”組 3.5 11.70±3.94**217.52±25.75**210.92±28.37**炮制品“二神丸”組 3.5 9.94±2.85**#206.91±31.12**#179.02±33.21**##

由表1可知，模型組血清中一氧化氮、胃動素、胃泌素水平與正常組相比均有顯著增高（P＜0.05）；給藥后，陽性藥物組、生品“二神丸”組和炮制品“二神丸”組均能調(diào)節(jié)三者含量，使趨于正常水平，且炮制品“二神丸”組對NO、胃動素和胃泌素的調(diào)節(jié)作用比生品“二神丸”組更明顯（P＜0.05～0.01）。

4 討論

現(xiàn)代研究認為一氧化氮（即血管內(nèi)皮舒張因子），在作為一種反應性極強的自由基，兼有第二信使和神經(jīng)遞質(zhì)作用，是與疼痛有關(guān)的一種非經(jīng)典的新型遞質(zhì)和信息傳遞分子，具有致痛和疼痛增敏的作用。許多研究證明健脾類藥物可以改善脾陽虛模型大鼠血漿中NO的水平[6～7]。還有研究認為一氧化氮的水平在腎陽虛證發(fā)病機制中具有重要意義[8]。胃動素與胃泌素是調(diào)節(jié)消化道功能的重要激素，胃動素具有促進胃腸蠕動的生理功能；胃泌素具有促進胃酸、胃蛋白酶分泌，促進消化道粘膜生長，促進胃腸道平滑肌收縮，松弛幽門括約肌等多種生理功能[9～11]。兩者在血漿中的水平與腹痛腹瀉有重要聯(lián)系。

脾腎陽虛泄瀉模型大鼠血清中一氧化氮、胃動素和胃泌素的含量明顯高于正常組，體現(xiàn)了大鼠經(jīng)造模后出現(xiàn)了胃腸運動機能興奮的情況，故表現(xiàn)為腹瀉。經(jīng)給藥后，伴隨著異常的血清一氧化氮、胃動素、胃泌素水平的恢復，大鼠的腹瀉情況也明顯有改善。復方“二神丸”中的藥物補骨脂和肉豆蔻經(jīng)過炮制后組方的“二神丸”組對大鼠血清中一氧化氮、胃動素和胃泌素的調(diào)節(jié)作用比生品“二神丸”組更為明顯，提示復方“二神丸”中藥物炮制后增強止瀉作用可能是通過糾正異常的一氧化氮水平和消化道激素而達到的。

[1] 林輝,胡昌江,李興迎,等.正交試驗法優(yōu)選補骨脂的鹽炙工藝[J].中國藥業(yè),2008,17(7):35.

[2] 代冬梅.肉豆蔻炮制工藝和質(zhì)量標準研究[D]. 遼寧:遼寧中醫(yī)學院,2005.

[3] 曲長江,劉勁,夏淑杰,等.番瀉葉瀉下與勞倦過度單、復因素脾虛模型的免疫學研究[J].中國中西醫(yī)結(jié)合脾胃雜志,1999,7(4):212.

[4] 王曉英,苗得雨,裴妙榮.復合式造大鼠脾腎陽虛模型[J].山西中醫(yī),2012,28(7):43-45,49.

[5] 陳英華,孫琪,歐陽軼強,等.腎陽虛證動物模型造模方法綜述[J].中國醫(yī)藥學報,2003,18(6):370.

[6] 康繼紅,陳繼婷.人參湯對脾陽虛大鼠血中NO/ET影響的實臉研究[J].貴陽中醫(yī)學院學報,2006,28(3)：18.

[7] 陳繼婷,王俊霞.大建中湯對脾陽虛疼痛大鼠模型血中NO β-EP影響的實驗研究[J].遼寧中醫(yī)藥大學學報,2008,10 (12):170.

[8] 高博,尹桂山.補腎藥對腎陽虛大鼠下丘腦組織蛋白激酶活性的影響[J].中國中醫(yī)基礎(chǔ)醫(yī)學雜志,2000,6(1):30.

[9] 姚永莉,宋于剛,張萬岱.脾虛泄瀉與胃動素關(guān)系的實驗研究[J].世界華人消化雜志,1999,7(5):432.

[10] 李秀賢,王珺.胃病患者血清胃液胃液素、胃動素和亮-腦啡肽的變化[J].新消化病學雜志,1995,3(4):199.

[11] 唐智敏,陳川明.肝郁脾虛患者血清胃泌素、胃動素的初步觀察[J].中國中西醫(yī)結(jié)合脾胃雜志,1994,2(3):25.

（責任編輯：陳思敏）

The infuence of “Ershen Wan” on NO, MTL and GAS in serum of the Spleen-Kidney Yang defciency rats before and after processing

PAN Xin, HU Chang-jiang, GENG Yuan-yuan, ZHAO Ling, XIONG Rui, CHEN Zhi-min//((Pharmacy College, Chengdu University of Traditional Chinese Medicine; The Ministry of Education Key Laboratory of Standardization of Chinese Herbal Medicine; State Key Laboratory Breeding Base of Systematic Research, Development and Utilization of Chinese Medicine Resources Co-founded by Sichuan Province and MOST, Chengdu 611137, China)

Objective:To compare the influence of two medicines before and after processing in “Ershen Wan” on the content of NO, motilin (MTL), gastrin (GAS) in serum of Spleen-Kidney Yang defciency rats, and provide experimental basis for mechanism of enhancing curative effect after processing.Method:50 SD male rats were randomly divided into 5 groups: normal, model, positive drug, “Ershen Wan”, and “Ershen Wan” processed. Spleen-kidney yang deficiency diarrhea rats model were established with composite factors. The plasma from arteria cruralis was collected after treatment, and the contents of NO, MTL, and Gas were detected using ELISA method.Result:NO、MTL、Gas in model group were signifcantly increased compared with normal group (P＜0.05). The positive, " Ershen Wan" and " Ershen Wan" processed groups can all signifcantly regulate the contents of NO, MTL, and Gas to normal level. Compared with " Ershen Wan " group, the impact on NO, MTL, and Gas was more significant in " Ershen Wan " processed group (P＜0.05～0.01).Conclusion:The component medicine in “Ershen Wan”after processing can strength antidiarrheal effects which suggest that the mechanism may be related to the mediation by retrieving abnormal levels of NO and gastrointestinal hormone.

Ershen Wan；processed products；NO；MTL； GAS

R 285.5

A

1674-926X(2014)05-009-03

國家自然科學基金面上項目（81274085）

成都中醫(yī)藥大學藥學院 中藥材標準化教育部重點實驗室 中藥資源系統(tǒng)研究與開發(fā)利用省部共建國家重點實驗室培育基地，四川 成都 611137

潘新，在讀博士研究生，主要從事中藥學研究Tel:18607196428 Email:px520520@126.com

胡昌江，教授，博士生導師，主要從事中藥炮制學的教學和研究Tel:13980980796 Email:hhccjj@hotmail.com

2013-12-26