中藥復方應激康對熱應激肉雞HS P70m RNA 表達影響的研究

武果桃，姜俊兵，牛國慶，任 杰，孟冬霞，趙 娟，牛 琛

（1.山西省農業科學院畜牧獸醫研究所，山西 太原030032；2.山西農業大學動物科技學院，山西 太谷 030800；3.太原市小店區畜禽繁育工作站，山西 太原030032；4.東北農業大學資源與環境學院，黑龍江哈爾濱150030）

隨著全球氣候溫室效應的不斷加劇及畜牧高度集約化生產的發展，熱應激對肉雞的危害日益嚴重。肉雞生長快、體型大、皮厚、皮下及腹部脂肪多，對熱應激的抵抗力差。熱應激是造成肉雞猝死癥的主要原因之一，嚴重制約肉雞養殖業的健康發展，給肉雞生產造成了嚴重的經濟損失。

熱休克蛋白（heat shock proteins，HSPs）是在高溫和其他應激條件下動物體內合成的一系列具有內源性保護作用的蛋白質，又名熱應激蛋白。HSP70 是HSPs 家族中最重要的一員，在結構上具有高度保守性。應激狀態下HSP70 在細胞內迅速合成，抵抗應激造成的組織細胞損傷，提高機體的熱耐受能力而起到保護機體的作用[1]，這種熱耐受能力主要與HSP70 有關[2-3]，而且與HSP70 的表達水平呈正相關［4-5］，一些抗熱應激中藥可通過提高HSPs 的表達來改善機體抗應激的能力［5-6］。HSPs 在應激條件下參與細胞的抗損傷、修復和熱耐受過程，保護細胞生命活動，國內關于環境和HSPs 基因表達的研究很少[7]。本試驗結合國內外熱應激對雞損傷的研究進展，人工制造熱應激病理模型，通過復方中藥對熱應激肉仔雞HSP70 mRNA 表達的研究，從分子水平提高對熱應激的防治效果，為中藥調控熱應激蛋白機理及熱應激的綜合防制提供一定的理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗動物與試驗藥物 健康18 日齡AA 肉仔雞120 只，購自山西省太原市小店區明生養殖場；試驗用中藥，購自太原市雙鶴藥業有限公司。藥方由山西省農業科學院畜牧獸醫研究所中獸醫藥研究室篩選研制，以刺五加、黃芪、元胡、黨參、五味子、山楂、甘草等藥物按一定比例組方。經水提濃縮、過濾成浸膏，然后加入糊精等載體混合、烘干、粉碎制成每克成藥含0.5 g 原生藥的中藥沖劑，再輔以一定維生素C 和維生素E 即得。于陰涼干燥處保存待用。

1.2 主要試劑 總RNA 提取試劑TRIZol（Invitrogen公司）；普通PCR試劑（北京康為世紀生物科技有限公司）；SYBR Premix（TaKaRa）；DM 2 000（北京康為世紀生物科技有限公司），瓊脂糖（Agarose），Tris（Sigma 公司）；其余異丙醇，氯仿，乙醇等均為新近購買的實驗室常規國產分析純試劑。

1.3 試驗設計 將120 只18 日齡健康AA 肉仔雞隨機分為4 組，即復方中藥組、維生素組、純中藥組和高溫對照組，每組30 只雞，每組設2 個重復，人工制造慢性熱應激病理模型，進行中藥防治肉雞熱應激試驗。試驗共進行18 d，預試期3 d、正式試驗期15 d。預試期間按常規進行飼養管理和防疫，正式試驗期各組基礎日糧完全相同，自由飲水，復方中藥組在飲水中按每天每只雞0.2 g 劑量添加自制中藥沖劑，維生素組按標準添加維生素，純中藥組只添加自制中藥沖劑，每日給藥一次，高溫對照組不添加任何藥物。熱應激環境溫度、濕度的調節見表1。溫濕度調節由溫濕度控制器控制。

表1 熱應激模型建立的溫度、濕度控制

1.4 組織處理 試驗結束后每組隨機選3 只雞(共12 只) 迅速宰殺，取出肝臟并用生理鹽水沖洗干凈，裝于冰凍管后立即放人液氮罐中冷凍。

1.5 組織總RNA 的提取 將采好的肝臟組織約0.5 g 從液氮中取出，放入已經灼燒好的研缽中，用液氮將組織研成粉末；將組織粉末放到有1 mL TRIZol 的1.5 mL 離心管中，劇烈混勻，靜置5 min；加入200 μL 氯仿混勻，靜置3 min，12 000 r/min（4 ℃）離心15 min；吸取400 μL 上清液加入等體積的異丙醇，室溫靜置10 min，12 000 r/min（4 ℃）離心10 min；取出，倒掉異丙醇，再加入1 mL 75%預冷的乙醇進行漂洗，7 500 r/min（4 ℃）離心5 min；倒掉乙醇，自然晾干，加入20 μL 的ddH2O（滅菌蒸餾水），充分混勻后，進行電泳檢測。

1.6 組織總RNA 質量鑒定 取1μL 分裝的RNA溶液，用核酸蛋白測定儀測定其濃度及A260、A260/280、A260/230 的值。然后用常規1.2%瓊脂糖凝膠電泳，檢測所提取RNA 的質量。

1.7 引物設計 根據美國國立生物技術信息中心（NCBI）公布的雞HSP70 基因序列和GAPDH 序列，應用Premier3.0 軟件設計引物，引物由北京六合華大基因科技股份有限公司合成。為了檢測各RNA 樣品完整性和反轉錄效率之間的差別，將待測樣品中的管家基因β-actin 設為內參照。引物序列如下：

HSP70mRNA sense：5′-GCGTAACACCACCATT CCC-3′ 19

HSP70mRNA antisense：5′-CGTCCTTTGTCATA GCCCTCT-3′ 21

GAPDH sense：5′-TGAAAGTCGGAGTCAACGG AT-3′ 21

GAPDH tisense：5′-ACGCTCCTGGAAGATAGT GAT-3′ 21

1.8 Real-Time RT-PCR 反應體系建立 cDNA 鏈的合成：10 μL 反應體系中含5×Prime ScriptTMBuffer 2 μL，total RNA 不多于5 00 ng，DEPC 水加至10 μL。上述成分混勻后置于PCR 儀器中，反應條件為37 ℃15 min；85 ℃5 s。RT 產物保存于-20 ℃備用。

1.9 Real-time RT-PCR 擴增條件建立 （1）反應體系：每個RNA 樣品分別使用目的基因和內參基因引物基因進行熒光定量PCR 反應。25 μL 反應體系如下：12.5μL SYBR?Premix，0.5 μL PCR Forward Primer（5 μmol/L），0.5 μL PCR Reverse Primer（5 μmol/L），1 μL cDNA 溶液，最后用ddH2O（滅菌蒸餾水）補充至25 μL；（2）反應條件：95 ℃預變性1 min 后，95 ℃10 s，61 ℃30 s，72 ℃30 s，72 ℃1 min；30 個循環。反應結束后，由熔解曲線判定PCR 反應的特異性，根據擴增動力學曲線的CT 值計算定量結果。內參基因β-actin 與目的基因在同一條件下不同管內擴增，每個樣本設3 次重復，最后取平均值。

1.10 標準曲線的制備 取2 μL cDNA 樣為模板，按2 倍濃度梯度稀釋，進行熒光定量PCR 反應。反應結果用IQ-5（美國biorad）自帶軟件自動進行數據分析并繪制標準曲線，以確定目的基因和內參基因擴增效率。

1.11 PCR 產物鑒定 根據產物片段大小，采用1%瓊脂糖凝膠電泳。5 μL 樣品與1 μL 溴酚藍混合后點樣，同時點DNA Marker 5 μL；電壓120 V 電泳20 min 后，紫外燈下觀察，凝膠成像系統采集圖像。運用DNA Marker 測算目的基因產物片段的大小。

2 結果

2.1 組織總RNA 的提取，提取效果如圖1。

圖1 總R NA 提取效果

提取的肝臟樣品總RNA，經濃度和純度檢測，各樣品的OD260/OD280比值均在1.8～2.0 之間，說明RNA 的純度很好。用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測發現，5 s、18 s 和28 s 帶均很清晰完整，說明提取和純化效果較好，RNA 未發生降解。可用于后續試驗。

2.2 RT-PCR 擴增結果 HSP70 mRNA 和GAPDH的擴增片段長度分別為228 bp 和111 bp。反應體系加入相應引物后，PCR 擴增產物與引物設計應擴增的片段相符，經擴增效率分析顯示，內參基因和HSP70 基因擴增效率均為95.5%；其相關系數R2 分別為0.999 和0.991；標準曲線斜率均為-3.435，可以應用Comparative Delta-delta Ct 法進行分析。

2.3 內參基因和HSP70 基因擴增動力學曲線分析及熔解曲線 見圖2、圖3。

圖2 內參基因和H S P70基因擴增動力學曲線

圖3 內參基因和H S P70基因熔解曲線

內參基因及HSP70 基因擴增動力學曲線符合標準的“S”型熒光增長曲線，并且平行性較好，基線平整拐點清晰，無明顯上揚趨勢。

2.4 擴增產物凝膠電泳分析 見圖4。

圖4 內參基因及H S P70擴增產物凝膠電泳

經熔解曲線和擴增產物凝膠電泳分析顯示，內參基因和HSP70 基因擴增產物Tm 值均一；分別只有一個單獨的峰。說明在實時定量過程中，熒光強度均來自于特異擴增產物，無引物二具體的產生，無非特異擴增。

2.5 熱應激雞肝臟組織中HSP70 實時定量PCR結果 見圖5。

圖5 H S P70實時定量PC R 結果

3 討論

HSP70 基因沒有內含子，這一特異性保證了它們一旦啟動轉錄就可產生出成熟的mRNA 以適應HSP70 大量快速表達的需要，防止應激對其mRNA 前體的影響。Craig 等（1991）報道，高溫可增強熱應激轉錄因子的活性，加強HSP70 mRNA合成，從而增加HSP70 質量濃度。

研究表明，女貞子、五味子和四君子湯都能顯著提高熱應激蛋雞肝臟HSP70 基因的表達，這幾種藥物的抗熱應激作用與其調控HSP70 基因表達有關[8]。本試驗中復方中藥沖劑組及純中藥沖劑組肉雞肝臟HSP70 基因表達量顯著提高，分別比高溫對照組、維生素組高2.98 倍、3.28 倍和4.66 倍、5.13 倍，說明本試驗中藥制劑可顯著提高熱應激肉雞肝臟HSP70 mRNA 的表達，增強抗熱應激能力。

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