重組白地霉脂肪酶催化菜籽油水解制備α-亞麻酸工藝的研究

付建紅 汪世娟 呂豪豪 白 希 王志勇

（新疆師范大學生命科學學院1，烏魯木齊 830054）

（新疆師范大學化學化工學院2，烏魯木齊 830054）

α-亞麻酸是人體必需的脂肪酸，不能在體內合成，必須從外界攝取。α-亞麻酸具有重要的生理作用和藥用價值。它可通過鏈延長酶和脫氫酶的雙重作用，轉化為具有降血壓、降血脂、抑制血小板凝聚和減少血栓形成等功效的EPA和DHA［1］。另外，α-亞麻酸還具有增強免疫力和抗炎作用、抑制癌癥的發生和轉移、保護視力和提高記憶力、抗氧化及延緩衰老等生理功能［2］。由于α-亞麻酸迄今不能人工合成，只能依賴于有限的自然資源，因此，進一步開發和探尋富含α-亞麻酸的自然資源，并深入研究α-亞麻酸的制取與純化技術及其α-亞麻酸延伸產品，對促進農業產業化、農業資源高效利用具有重要意義。

菜籽油是以油菜的種子榨制所得的透明或半透明狀的液體，是我國主要食用油之一，也是世界上第三大植物油。菜籽油中含有較多不飽和脂肪酸，其中α-亞麻酸質量分數達8%～10%，高于其他常見的食用油。新疆油菜種植面積達134.3萬畝，菜籽油的產量相當可觀，如因地制宜地利用菜籽油生產α-亞麻酸，對擴大菜籽油的利用價值以及油料資源的深加工利用具有廣泛而深遠的意義。

在α-亞麻酸的制備過程中油脂的水解尤為關鍵，油脂水解率的提高，將會為后續提高目標產物的得率奠定基礎。傳統的油脂水解工藝是采用高溫高壓或強酸強堿法，需要耐高壓抗腐蝕設備，投資大，耗能多，環境污染嚴重，勞動條件差，而且不適用于熱敏性油脂，如含多不飽和脂肪酸的油脂。酶法水解油脂則正好克服了上述缺點，而且具有選擇性，可減少副反應，提高產品的質量和得率［3-4］。本試驗所用的重組脂肪酶來源于白地霉，而白地霉脂肪酶水解菜籽油，可將甘油3個酯鍵上的不飽和脂肪酸優先釋放出來［5］，這對于菜籽油中α-亞麻酸釋放是很有利的。目前，對紫蘇籽油、亞麻籽油、花椒籽油、獼猴桃籽油及橡膠籽油中α-亞麻酸的富集研究已有文獻報道［6-14］，但利用重組脂肪酶對菜籽油中α-亞麻酸進行富集的研究鮮見報道。本研究利用微生物發酵技術大量制備的重組脂肪酶水解菜籽油制備α-亞麻酸，可最大化的降低生產成本，為獲得較高含量的α-亞麻酸及菜籽油的進一步開發利用提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 原料與試劑

福臨門一級菜籽油：中糧集團（市售）；重組脂肪酶（8 000～10 000 U／g）：實驗室自制；酚酞、吐溫 -80、聚乙烯醇、橄欖油：均為化學純；正庚烷：色譜純；硬脂酸甲酯、棕櫚酸甲酯、油酸甲酯、亞油酸甲酯、α-亞麻酸甲酯：美國Sigma公司。

1.1.2 儀器

島津GC-9A型氣相色譜儀：島津企業管理（中國）有限公司；TS-211C天呈臥式恒溫振蕩器：上海天呈實驗儀器制造有限公司；RE52B旋轉蒸發儀：上海亞榮生化儀器廠；DF-101S集熱式恒溫加熱磁力攪拌器：金壇市佳美儀器有限公司；2-16實驗室通用型離心機：德國希格瑪（Sigma）離心機有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 菜籽油混合脂肪酸的制備

稱取一定量菜籽油于250 m L三角瓶中，按比例加入0.025 mol／L磷酸緩沖溶液，再加入5%（油）吐溫-80和一定量的脂肪酶，置于200 r／min恒溫振蕩器內進行水解反應。反應一定時間后取出25 m L水解產物，離心，上清液中加入正己烷萃取，有機相水洗至中性，用無水硫酸鈉脫水，減壓蒸餾回收溶劑，獲得菜籽油混合脂肪酸，測定酸值、計算水解率，并用氣相色譜儀測定其中脂肪酸組分的含量。

1.2.2 重組脂肪酶水解菜籽油的正交試驗

在單因素試驗的基礎上，選取pH值、加酶量、水解時間和水油比4個因素，以水解率為評價指標，采用四因素三水平的正交試驗L9（34），優化脂肪酶催化菜籽油水解的工藝條件。正交試驗因素水平見表1。

表1 重組脂肪酶水解正交試驗因素水平表

1.2.3 尿素包合法富集α-亞麻酸工藝

按一定的配比將乙醇和尿素加入燒瓶中，開啟機械攪拌，在65℃的水浴鍋中回流至尿素完全溶解，再加入一定比例的混合脂肪酸繼續攪拌至溶液澄清透明。在一定的溫度下冷卻結晶一定的時間，迅速抽濾。濾液經減壓旋蒸除去多余的溶劑乙醇，分別用稀酸和正己烷洗滌至中性，再用無水硫酸鈉干燥，得到富集的α-亞麻酸。

根據前期單因素試驗，確定包合時間、尿素∶脂肪酸比、乙醇比∶尿素對α-亞麻酸的含量影響很大。采用L9（34）正交試驗對富集α-亞麻酸的工藝條件進行優化。正交試驗因素選取包合時間14、20、26 h，尿素∶脂肪酸（m∶m）（2、4、6）∶1，乙醇 ∶尿素（V∶m）（5、7、9）∶1。

1 .2.4 脂肪酸組成分析測定

菜籽油及富集后的不飽和脂肪酸先進行甲酯化，再進行氣相色譜分析其脂肪酸組成。甲酯化方法參照文獻［14］。GC分析條件為：DB-WAX型色譜柱（30 m×0.32 mm×0.25μm）；進樣口溫度240℃；檢測器溫度 260℃；載氣流速為 1.2 mL／min；程序升溫為初始溫度80℃，保留2 min，以5℃／min升溫至 140℃，保持 5 min，然后以 2.5℃／min升至230℃，保持10 min；進樣量為1μL；分流比 35∶1。

2 結果與分析

2.1 菜籽油脂肪酸組成

菜籽油的脂肪酸甲酯氣相色譜圖見圖1。與脂肪酸甲酯標準品的氣相色譜圖對比可知，菜籽油中初步定性了5種脂肪酸，它們的組成含量見表2。

圖1 菜籽油中脂肪酸的氣相色譜圖

表2 菜籽油脂肪酸組成的分析結果

從表2可知，原料菜籽油中不飽和脂肪酸的質量分數達94.62%，其中以油酸的含量最高，其次是亞油酸，α-亞麻酸質量分數為8.03%。利用脂肪酶水解法和尿素包合法可將飽和脂肪酸、單不飽和脂肪酸及多不飽和脂肪酸進行一定的分離，進而得到較高含量的α-亞麻酸。

2.2 正交試驗優化重組脂肪酶水解的工藝條件

在單因素試驗的基礎上，選取pH（A）、加酶量（B）、水解時間（C）和水油比（D）4個因素作為影響因素，在酶促反應溫度42℃的條件下，探討各因素對油脂水解率的影響，并找出最大的影響因素。正交試驗結果見表3。

表3 重組白地霉脂肪酶水解正交試驗結果與分析

從表3中的極差分析可以看出，4個因素對菜籽油水解率影響的主次順序為A＞D＞C＞B，即pH值影響最大，加酶量影響最小。以水解率為評價指標時重組白地霉脂肪酶水解菜籽油最佳的工藝條件為A1B3C3D3，即當水／油為 1.5∶1，pH為 8.0，加酶量為250 U／g油，反應18 h的菜籽油水解率為40.1%。

2.3 尿素包合法富集菜籽油α-亞麻酸的條件優化

在各單因素試驗基礎上，本試驗選定包合時間、尿素∶脂肪酸（m∶m）、乙醇∶尿素（V∶m）3個因素，每因素取3水平，選用L9（34）正交設計試驗，以α-亞麻酸相對含量和得率為指標進一步研究各因素對α-亞麻酸富集程度的影響。正交試驗結果見表4。

由表4中極差分析可知，各因素對尿素包合菜籽油中α-亞麻酸含量的影響次序為A＞B＞C，即尿素∶脂肪酸＞乙醇∶尿素＞包合時間。對得率的影響順序也是A＞B＞C，即尿素∶脂肪酸＞乙醇∶尿素＞包合時間。正交試驗結果表明，使α-亞麻酸相對含量達到最高的組合為A2B1C3，得率達到最高的組合為A3B3C1，在確定最佳工藝條件時，應綜合考慮α-亞麻酸的含量與得率。如果加大尿素用量，部分α-亞麻酸也與尿素包合，使α-亞麻酸的含量降低，所以A選水平2。溶劑乙醇用量太多，α-亞麻酸難以與之分離，影響產品α-亞麻酸含量，也造成溶劑浪費，所以B選水平1。包合時間對尿包后α-亞麻酸的含量和得率影響都比較小，為節約能源C選取水平1。確定適宜的包合條件為A2B1C1，即m（脂肪酸）∶m（尿素）∶V（乙醇）為 1∶4∶20、包合時間14 h，在-20℃條件下包合所得α-亞麻酸的質量分數為19.24%，得率為5.13%。

表4 尿素包合正交試驗結果與分析

圖2 尿素包合富集后的不飽和脂肪酸氣相色譜圖

2.4 尿素包合富集前、后菜籽油不飽和脂肪酸組成的比較

尿素包合富集后的脂肪酸甲酯氣相色譜圖見圖2，經與尿素包合前菜籽油的脂肪酸氣相色譜圖（圖1）比較，富集后的脂肪酸中初步定性了3種不飽和脂肪酸即油酸、亞油酸和α-亞麻酸，而棕櫚酸和硬脂酸已檢測不出來。由圖2可見，富集后的亞油酸和α-亞麻酸的相對含量明顯高于富集前原料菜籽油中亞油酸和α-亞麻酸的含量，而油酸的相對含量與之相比顯著降低。結果表明，尿素包合能將飽和脂肪酸（棕櫚酸和硬脂酸）以及部分油酸除去，而亞油酸和α-亞麻酸被富集，含量明顯提高。亞油酸和α-亞麻酸碳鏈長度相同，且只相差一個不飽和鍵，因此很難將其分離。

3 結論

在反應時間18 h、反應溫度42℃條件下，通過正交試驗優化得到重組白地霉脂肪酶水解菜籽油的最優工藝條件為∶水油比1.5∶1，pH 8.0，酶用量250 U／g。在此條件下菜籽油的水解率最大達40.1%。酶法制備脂肪酸是一項較先進的提取技術，而重組白地霉脂肪酶水解菜籽油效果明顯，本研究為利用該酶水解其他動植物油脂制備脂肪酸提供了基礎數據。

通過正交試驗優化的尿素包合法富集菜籽油中α-亞麻酸的最佳條件為m（脂肪酸）∶m（尿素）∶V（乙醇）為 1∶4∶20，包合時間為 14 h，包合溫度為-20℃，產品中α-亞麻酸質量分數由8.03%提高到19.24%。表明采用尿素包合法純化富集菜籽油中α-亞麻酸是可行的，尿素包合法是大幅度提高不飽和脂肪酸含量的有效途徑之一。尿素包合法工藝簡單，易于操作，生產成本低廉，溶劑可回收再利用，且此過程在低溫下進行，對不飽和脂肪酸的分子結構和理化性質不會產生影響，可作為實現工業化生產的工藝技術參考。

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