利用酵母細胞對薄荷油進行微膠囊化的研究

程玉霞 程 丹 關鵬翔 盧錦麗 武 肖 傅玉穎

（浙江工商大學食品與生物工程學院，杭州 310012）

酵母細胞是球形或橢球形的單細胞生物，直徑從幾微米到20μm，安全無毒［1］，來源廣泛，生長繁殖迅速并且易于大規模培養［2］，具有天然的真核細胞典型結構，其完整的細胞壁和細胞膜結構具有一定的強度和通透性，是理想的微膠囊壁材［3］。酵母細胞作為微膠囊壁材具有獨特的優點［4］：在微膠囊制備過程中不需要或很少添加其他化學試劑，只需水、酵母細胞和活性芯物質高頻度接觸即可；對芯物質載荷能力可達70%以上，非常適合藥物和食品添加劑的包覆；具有天然的雙層囊腔結構［5］，可以避免揮發性物質的揮發，也可以避免光照、氧氣所引起的氧化變質；獲得的微囊產品大小均一、無毒、生物相容性好、易生物降解。目前，酵母微膠囊化技術的應用范圍包括食品、醫藥、化妝品、生物型農藥、紡織品［4，6］、戒煙產品中封裝尼古丁［7］和無碳復寫紙等多個領域。

薄荷油是唇形科植物薄荷的新鮮莖葉經蒸餾、冷凍、部分脫脂加工得到的無色或淡黃色澄清芳香揮發油［8］，它具有疏風散熱、消炎鎮痛、清利頭目、止癢安神等功效，在國內外被廣泛用于食品、保健品、醫藥、飲料、日用化工等領域［9］。薄荷油極易揮發，在常溫下為液態，遇光和熱不穩定，在加工中不耐高溫，加工的穩定性與貯藏穩定性差，嚴重限制了其發展應用。

為了提高薄荷油在加工與貯存過程中的穩定性能，更好地發揮薄荷油的功效，本試驗采用酵母細胞將薄荷油微膠囊化，使其從揮發性強的液態香料轉變成粉末香料，主要運用BBD設計原理探討研究了酵母微膠囊化薄荷油的工藝，并通過紅外光譜觀察來表征薄荷油微膠囊。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

啤酒干酵母：食品級，湖北安琪酵母股份有限公司，細胞內脂含量2.0%～2.5%；薄荷油：食品級，鄭州藍宇化工有限公司；尼羅藍A：Nile Blue A，合肥博美生物科技有限責任公司；其他試劑均為分析純。

D-1-50真空冷凍干燥機：北京博醫康實驗儀器有限公司；78HW-1數顯恒溫磁力攪拌器：杭州儀表電機有限公司；UV-3200PC紫外分光光度計：上海美譜達儀器有限公司；傅里葉紅外光譜儀：美國Thermo公司；3K30高速冷凍離心機：德國Sigma公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 薄荷油微膠囊的制備

按一定芯壁比將薄荷油與活化后的酵母細胞混合，加水，置于恒溫磁力攪拌器中攪拌一定時間，離心后傾出，真空抽濾回收未包入油，再用乙醇洗去酵母細胞表面殘留的薄荷油。真空冷凍干燥24 h，得到薄荷油微膠囊。薄荷油被包埋在酵母細胞中。

工藝流程：酵母→活化→加入薄荷油和水→攪拌→離心→真空抽濾→清洗→冷凍干燥→微膠囊→包裝→儲存。

1.2.2 薄荷油微膠囊效果的評定

準確稱取0.2 g微膠囊后加入20 mL無水乙醇，在60℃下超聲波浸提80 min后過濾，采用紫外分光光度法測定薄荷油濃度。對薄荷油無水乙醇溶液，薄荷油微膠囊的乙醇抽取液及干酵母的乙醇抽提液（空白）在200～600 nm進行波譜掃描，發現薄荷油無水乙醇溶液及微膠囊的乙醇抽取液均在204 nm下有最大吸收峰，與文獻報道一致［3］，而干酵母的乙醇抽提液（空白）在204 nm處沒有明顯的吸收峰。得到薄荷油濃度和吸光度的線性方程y＝1.039 8x-0.008 1，R2＝0.998 8，式中：x為吸光度；y為濃度；R2為相關系數。

微膠囊化效果用包埋率來衡量，計算公式如下：

包埋率＝酵母微膠囊中薄荷油質量／初始薄荷油總質量×100%

1.2.3 微膠囊制備工藝的優化

在考察了芯壁比、包埋溫度、包埋時間、加水量等單因素包埋條件的基礎上，以包埋溫度、包埋時間、加水量3個因素作為自變量，以薄荷油包埋率為響應值，根據BBD（Box-Behnken design）試驗設計原理，進行三因素三水平試驗設計，采用Design Expert7.1.3軟件處理數據，試驗因素及水平。

表1 試驗因素與水平

1.2.4 傅里葉紅外儀觀察

采用溴化鉀壓片法。將酵母細胞、薄荷油微膠囊以及薄荷油與壁材的物理混合物分別與KBr按2∶200（質量）的比例混合、壓片，在傅里葉紅外光譜儀上測量透光率。壓片時控制微膠囊和混合物中薄荷油的量一致。

2 結果與討論

2.1 單因素對薄荷油包埋率的影響

2.1.1 芯壁比的影響

在包埋溫度45℃，包埋時間5 h，加水量10 mL條件下，研究芯壁比為 1∶1、2∶1、3∶1、4∶1、5∶1對薄荷油包埋率的影響。結果如圖1所示。

圖1 芯壁比對薄荷油包埋率的影響

由圖1可知，芯壁比對薄荷油包埋率的影響不大。當芯壁比小于2∶1時，薄荷油包埋率隨芯壁比的增大而增大，當芯壁比為2∶1時，薄荷油包埋率達到最大值，當芯壁比大于2∶1時，薄荷油的包埋率反而隨著芯壁比的增大而略有下降，但變化幅度不是很大。分析原因可能是由于薄荷油通過自由擴散進入酵母細胞［10］，當芯壁比增大時，進入酵母細胞內薄荷油含量也相應增大。綜合考慮選擇芯壁比1∶1。

2.1.2 包埋溫度的影響

在芯壁比為1∶1，包埋時間為5 h，加水量為10 mL的條件下，研究包埋溫度為 35、40、45、50、55、60℃對薄荷油包埋率的影響。結果如圖2所示。

圖2 包埋溫度對薄荷油包埋率的影響

由圖2可知，包埋溫度對薄荷油的包埋率影響較大。當溫度小于45℃時，薄荷油的包埋率隨著溫度的升高而不斷增大；當溫度達到45℃時，薄荷油包埋率達到最大；然而，當溫度大于45℃時，隨著溫度的繼續升高，薄荷油的包埋率反而不斷減小。分析原因可能是酵母細胞通過自由擴散包埋薄荷油，溫度升高會增大酵母細胞壁和細胞膜的通透性，加快分子運動速度，從而促使薄荷油向酵母細胞內擴散，提高薄荷油包埋率。但溫度過高會加快薄荷油的氧化與蒸發，從而降低薄荷油包埋率。

2.1.3 包埋時間的影響

在芯壁比為1∶1，包埋溫度為45℃，加水量為10 mL的條件下，研究包埋時間 3、4、5、6、7 h對薄荷油包埋率的影響。試驗結果如圖3所示。

由圖3可知，包埋時間對薄荷油的包埋率影響較大。當包埋時間小于5 h時，隨著時間的延長，薄荷油的包埋率不斷增大；當時間延長到5 h時，薄荷油的包埋率達到最大，然而隨著包埋時間的繼續延長，薄荷油的包埋率反而不斷下降。分析原因是：時間的延長使得通過自由擴散進入酵母細胞的薄荷油量增大，然而時間過長，薄荷油會容易蒸發和氧化，從而降低薄荷油包埋率。

圖3 包埋時間對薄荷油包埋率的影響

2.1.4 加水量的影響

在芯壁比為1∶1，包埋溫度為45℃，包埋時間為5 h的條件下，研究加水量為 5、10、15、20、25、30 mL／g對薄荷油包埋率的影響。試驗結果如圖4所示。

由圖4可知，加水量對薄荷油的包埋率影響較大。當加水量小于15 mL／g時，隨著加水量的增大，薄荷油的包埋率不斷增大；當加水量達到15 mL／g時，薄荷油的包埋率達到最大；然而當加水量大于15 mL／g時，隨著加水量的繼續增大，薄荷油的包埋率反而不斷減少。分析原因為：加水量是包埋進行的必要介質，加水量增加時會促進薄荷油進入酵母細胞內，然而由于薄荷油通過自由擴散的方式進入酵母細胞內，加水量過多會稀釋薄荷油，導致進入酵母細胞的薄荷油量減少，從而引起薄荷油包埋率下降。

圖4 加水量對薄荷油包埋率的影響

2.2 響應面試驗結果及分析

根據Box-Behnken design（BBD）試驗設計原理，選取15個試驗點，以包埋溫度、包埋時間、加水量3個因素作為自變量，以薄荷油包埋率為響應值，試驗設計及結果見表2。

表2 響應面設計及結果

采用Design Expert 7.1.3軟件對表2的數據進行多元回歸分析，得到包埋率（Y）與溫度（A）、時間（B）與時間（C）的二次回歸方程：

Y＝53．63＋7．77A＋3．13B-8．34C＋2．06AB-0．51AC-4．27BC-8．315A2-20．33B2-6．07C2

回歸方程系數顯著性檢驗結果見表3，各因素及其交互作用對薄荷油包埋率的影響主次次序為B2＞C＞A＞A2＞C2＞B＞BC＞AB＞AC，各因素對試驗結果的影響依次為時間＞溫度＞加水量，建立的二次回歸方程具有極顯著性（P＜0.000 1），失擬項0.187 8＞0.05，不顯著，說明該模型擬合程度好，試驗誤差小，可以用此模型對酵母微膠囊化薄荷油工藝進行分析和預測。

表3 回歸方程系數顯著性檢驗

圖5～圖7反應各因素之間交互作用對包埋率的影響，可知包埋溫度和包埋時間、包埋時間和加水量的交互作用對包埋率影響顯著，而包埋時間和加水量的交互作用對包埋率影響不顯著；3個因素對包埋率的影響順序依次為：時間＞溫度＞加水量，與顯著性分析結果一致。

圖5 溫度和時間對薄荷油包埋率影響的交互作用

圖6 溫度和加水量對薄荷油包埋率的交互影響

圖7 時間和加水量對薄荷油包埋率的交互影響

2.3 最佳工藝條件及驗證

由包埋率的回歸方程得到酵母微膠囊化薄荷油的最佳工藝條件：溫度為48.35℃，時間為6.56 h，加水量為13.15 mL／g，包埋率可達57.15%。采用上述最優條件進行試驗，同時結合實際操作情況，將包埋率試驗條件調整為：溫度48℃，時間6 h，加水量13 mL，在此條件下進行3次驗證試驗，平均包埋率為57.33%，與預測值十分接近。由此可見，利用響應面法優化得到的酵母微膠囊化薄荷油工藝參數準確可靠。

2.4 傅里葉紅外光譜試驗

對酵母細胞、薄荷油微膠囊以及薄荷油與酵母細胞進行紅外掃描，紅外光譜圖見圖8。由圖8可知，酵母細胞紅外光譜曲線與文獻報道非常相似［11］。薄荷油微膠囊與酵母細胞的紅外光譜曲線無明顯的差異，但與薄荷油和酵母混合物的紅外曲線有明顯差異，由此說明薄荷油已包埋在酵母中。

圖8 酵母、微膠囊以及薄荷油與酵母混合物的紅外光譜

3 結論

在單因素試驗基礎上，選定包埋溫度、包埋時間和包埋溫度為目標變量，采用BBD響應面法，以包埋率為響應值指標，建立二次項回歸模型：Y＝53.63＋7.77A＋3.13B-8.34C＋2.06AB-0.51AC-4.27BC-8.315A2-20.33B2-6.07C2。所得模型方程（P＜0.01）具有極顯著性，失擬項（P＞0.05）不顯著，說明方程擬合程度良好。3個因素的主次關系為時間＞溫度＞加水量。優化得到薄荷油的最佳微膠囊化條件為：溫度48℃，時間6 h，加水量13 mL／g，薄荷油包埋率高達為57.33%。傅里葉紅外光譜圖中薄荷油微膠囊與酵母壁材的紅外光譜曲線基本相同，表明薄荷油微膠囊薄荷油已被包入酵母壁材內。

［1］蔣和體，劉曉麗.酵母胞壁微膠囊化姜油及其釋放規律的研究［J］.中國糧油學報，2005，20（6）：91-97

［2］Mitsuyoshi U，Atsuo T.Cell surface engineering of yeast：Construction of arming yeast with biocatalyst［J］.Journal of Bioscience and Bioengineering，2000，90（2）：125-136

［3］鄒克琴，王金宇，李淑芬，等.利用干酵母細胞微膠囊化丁香油的研究［J］.農業工程學報，2006，22（9）：206-209

［4］Nelson G.Application ofmicroencapsulation in textiles［J］.International Journal of Pharmaceutics，2002，242：55-62

［5］薛峰，黃曉青.微膠囊技術主要方法概論［J］.食品科學，1990（11）：5-8

［6］Sager B，Wales D，Nelson G.Treating Materials.International patentWO／010772［D］.1992

［7］McNeight D L.Nicotine Delivery Systems.European patent EP1176961［D］.2000

［8］中華人民共和國國家藥典委員會.中華人民共和國藥典［S］.北京：化學工業出版社，1995

［9］李靜茹，金征宇.可降解淀粉微球吸附薄荷油的研究［J］.食品與生物技術學報，2006，25（5）：25-34

［10］Bishop J.R.P，Nelson G.Microencapsulation in yeast cells［J］.Journal of Microencapsulation，1998，15（6）：761-773

［11］Burattini E，Cavanga M，Dell Anna R，et al.An FT-IR microspectroscopy study of autolysis in cells of the wine yeast Saccharomyces cerevisiae［J］.Vibrational Spectroscopy，2008，47：139-147.