伊犁地區綿羊李氏桿菌藥敏特性及平板凝集快速診斷方法的建立

皮志媛，王一明，張海蘭，雷程紅

(1.新疆農業大學，新疆烏魯木齊 830052；2.伊犁職業技術學院，新疆伊犁 835000)

李氏桿菌疾病是重要的人畜共患傳染病之一，主要由單核細胞增多性李氏桿菌引起，呈世界性分布。自1926 年首次分離到該病原以來，目前已呈世界性分布，作為致病菌和腐生植物致病菌而廣泛存在于環境中[1-2]。自1995年以來，先后在新疆石河子、奎屯、精河、哈密、伊犁等地區暴發綿羊李氏桿菌病，給養羊業帶來了巨大的損失[3]。筆者通過對李氏桿菌分離株進行藥敏試驗，用甲醛滅活苗免疫試驗動物制備特異性抗體，將特異性抗體與抗原進行平板凝集試驗，建立一種快速準確檢測李氏桿菌病的方法。

1 材料與方法

1.1菌種來源分離株由伊犁職業技術學院微生物實驗室分離獲得。標準株由石河子大學微生物實驗室惠贈。

1.2試驗動物兔子3只，購自實驗動物中心，品種為日本大耳白，無天然凝集素，且經各項體檢級別為清潔級。

1.3培養基改良馬丁肉湯培養基、改良馬丁肉湯瓊脂平板、戊糖發酵管、硝酸鹽試驗培養基、甲基紅試驗培養基、VP試驗培養基。培養基均按照產品說明書配制方法進行配制，將pH均調至李氏桿菌的最佳生長pH7.0～7.2。

1.4分離菌株的純化將試驗室保存的分離菌株在改良馬丁瓊脂平板上劃線，于37 ℃ 恒溫培養箱中培養14 h，然后挑取生長良好、邊緣整齊的單個菌落接種于含5 ml改良馬丁肉湯的試管中，于37 ℃ 恒溫培養箱中培養約14 h，置于4 ℃ 冰箱中保存備用。

1.5抗藥性鑒定將菌液均勻涂布于培養基表面，置于37 ℃ 恒溫培養箱培養18～20 h后觀察并記錄結果。此次抗藥性試驗包括氨芐西林、慶大霉素、左氧氟沙星、多粘菌素、鏈霉素、頭孢唑啉、頭孢他啶、頭孢呋辛鈉等8種藥敏試驗。

1.6高免血清的制備

1.6.1增菌培養。吸取分離純化過后的菌液10 μl，接種于含50 ml 改良馬丁肉湯的錐形瓶中，置于37 ℃ 恒溫培養箱中培養約14 h。

1.6.2菌落計數。從增菌后的馬丁肉湯中吸取1 ml菌液，10倍稀釋至10-10，以10-5、10-6、10-7、10-8、10-95個濃度進行菌落計數，用以確定菌液中細菌的含量，并據此將菌液調節至40億/ml。

1.6.3滅活抗原的制備。在調節濃度后的菌液中加入一定量的甲醛溶液，使甲醛的最終含量為0.4%，滅活時間約24 h，在此期間每隔約2 h搖晃1次，以保證滅活完全。滅活后加入佐劑，除第1次加入的為弗氏完全佐劑外，其余均為弗氏不完全佐劑。加入佐劑后，應使滅活的菌液與佐劑充分混勻，最終形成“油包水”的結構。

1.6.4免疫試驗動物。按照0.5 ml/kg體重計算，給試驗兔經背部皮下多點注射法第1次接種疫苗。此后每隔7～8 d進行1次免疫，共免疫3次。

1.6.5免疫血清的收集。采取心臟采血法，體重2.5 kg家兔1次可取血20～30 ml。取血完畢后馬上將所采集血液分裝入無菌大試管內，斜置，待血液凝固后，置于37 ℃ 恒溫箱中30 min，使血清充分析出，吸取上清于干凈離心管中，于5 000 r/min離心10 min，再取上清液加入防腐劑(0.01%硫柳汞或0.02%疊氮鈉，最終濃度)，測定抗血清的效價，封好瓶口，貼好標簽，注明抗血清名稱、效價及日期，置于冰箱中保存備用[4-7]。

1.7平板凝集方法的建立

1.7.1最佳凝集稀釋度的測定。抗原共制備成2個濃度，即原濃度和二倍濃度。先以原菌液10倍稀釋至原濃度的10-10倍，取合適濃度進行菌落計數，以確定原菌液中菌體濃度。然后，取1 ml原濃度菌液以3 000 r/min的速度離心10 min，棄去上清液，添加生理鹽水至0.5 ml，即制成二倍濃度的抗原。取8孔玻璃板，用生理鹽水倍比稀釋抗體血清，稀釋成1∶1、1∶2、1∶4、1∶8共4個濃度梯度，從左至右依次加至各孔中。在2行孔中1行加入二倍抗原，另1行加入原濃度抗原，在3～5 min內讀取結果。同時，設立陰性對照。凝集反應最好的稀釋度即為最佳凝集稀釋度。

1.7.2判定標準。按照下列標準記錄反應結果：若出現“++++”，記為100% 凝集；若出現“+++”，記為75% 凝集；若出現“++”，記為50% 凝集；若出現“+”，記為25% 凝集；以出現“++++”作為陽性的判斷標準。

在陽性血清與凝集抗原出現明顯凝集顆粒，陰性血清與凝集抗原之間仍均勻渾濁的前提下，陽性血清與待檢抗原出現明顯凝集顆粒，則判為陽性；如果均勻渾濁，則判為陰性，介于二者之間，則判為可疑。

1.7.3特異性試驗。以副溶血弧菌作為抗原，濃度為最高抗原凝集濃度，用已免疫血清作為抗體，以最佳抗體凝集濃度進行平板凝集試驗，在3 min內觀察并記錄試驗結果[8-10]。

2 結果與分析

2.1分離菌株的純化試管內容物變得渾濁，顏色稍微變暗，試管底部出現小顆粒狀沉淀，表層有不明顯菌膜，不貼壁生長，搖晃后底部沉淀混入菌液，菌液更加渾濁，靜置后不久又出現沉淀。

2.2抗藥性試驗藥敏結果按照美國臨床試驗室標準化協會(CLSI，2006)的標準進行判斷，其中，卡那霉素判斷標準參照紅霉素的標準，頭孢唑林和頭孢噻肟參照青霉素的標準，CLSI未建議使用的藥物僅報告其抑菌圈直徑，不進行敏感性

分析。常用的8種抗菌藥的檢測結果表明5株分離菌株對氨芐西林、慶大霉素、鏈霉素高度敏感，而對頭孢唑林、左氧氟沙星、和多粘菌素中度敏感；而對頭孢他啶、頭孢呋辛鈉耐藥性較強(表1)。

表1 分離菌株的藥敏試驗

注：藥敏片直徑為6.0 mm。

2.3平板凝集試驗

2.3.1菌落計數。將生長良好、菌落分散均勻的平板進行菌落計數，結果如表2所示。

表2 菌落計數結果

注：“-”表示菌落數目多，不可數。

2.3.2最佳凝集度的測定。試驗所用的血清為經3次免疫以后所采集血清，按稀釋梯度凝集后，結果出現凝集度不一的凝集反應，而陰性對照沒有出現任何凝集(圖1)。濃縮1倍的抗原和稀釋1倍的血清出現最大強度凝集，據此可判定血清的最佳凝劑濃度為原血清的2-1。

2.3.3抗體血清的特異性試驗。4個濃度的血清和2個濃度的抗原進行矩陣凝集試驗，結果均不出現任何凝集。由此可見，血清的平板凝集試驗具有較強的特異性。

2.3.4平板凝集檢測。取待檢抗原直接以最高濃度和抗體血清進行凝集試驗，如發生明顯的凝集反應，即可檢測、診斷李氏桿菌病。

注：a.陽性血清；b.陰性對照。圖1 最佳凝集濃度的測定

3 討論

3.1抗藥性試驗李氏桿菌是細胞內寄生菌，且易產生耐藥性，給臨床治療帶來很大的困難，所以治療該病時應通過藥敏試驗選擇敏感的抗生素，才能達到滿意的治療效果。此次藥敏試驗結果表明該分離菌株對氨芐西、林慶大霉素、鏈霉素高度敏感，對頭孢唑林、左氧氟沙星和多粘菌素中度敏感；對頭孢他啶、頭孢呋辛鈉的耐藥性較強。因此，選用敏感藥物對發病畜群進行了治療，對尚未發病動物進行了預防，即可使病情較快得到控制[10]。

另外，由于李氏桿菌容易產生耐藥性，故在進行該病的治療時應避免長時間使用同一種或同一類抗生素，以避免或減緩其強耐藥性菌株的出現。在抗生素的選用方面應符合用藥標準，注意休藥期，盡量降低畜禽產品中抗生素類藥物的殘留。謹慎使用新一代抗生素，除特別緊急情況外，不使用非常規藥物治療[11]。

3.2平板凝集試驗平板凝集檢測方法檢測速度快，一般在3 min內作出診斷。Wan J 等[12]設計完成的已商業化的PCR 診斷試劑盒，檢測LM 的結果與國際準方法(ISO)相當，但PCR法需要48 h，而ISO法至少需要5 d。傳統的分離鑒定方法耗時則更長。

平板凝集檢測方法成本低，采用酶免疫分析法(EIA )檢測血清型1和4b LM “O”和“H”抗原，結果與凝集試驗相一致，但是EIA所需儀器復雜且用到的試劑比較昂貴。應用LLO乳膠凝集分析(LLOLAT)可以檢測富集培養物包括肉、奶和奶產品中LM 污染[13]，但是LLOLAT步驟較平板凝集復雜，因此總價也比平板凝集試驗高。Cocolin[14]建立了一種新的檢測鑒定食品中L.spp和LM 的分子方法，用來自5個種的iap( inva 2 sion associated protein)基因擴增片段和PCR 產物的變性梯度膠電泳(DGGE)，使5個種容易得到快速分離和鑒定，這種檢測方法雖然比較精準，但是由于其對成本要求過高而難以大范圍推廣。

平板凝集檢測方法結果穩定，Kliger 等在食品檢測中首先引入了16S rRNA 序列的核酸雜交法，但易出現假陽性。特異性試驗表明李氏桿菌平板凝集試驗方法具有較強的特異性，因為抗原抗體的凝集反應具有特異性。特異性可以保證該試驗結果比較穩定，表明陽性檢出率更接近真實，誤診的概率更小。

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