hsa-miR-197在子宮肌瘤中的表達及生物信息學特征分析

徐 青，付子毅，吳小莉，皇甫玉爽，凌 靜

(南京醫科大學附屬南京市婦幼保健院婦科，南京 210004）

hsa-miR-197在子宮肌瘤中的表達及生物信息學特征分析

徐 青，付子毅，吳小莉，皇甫玉爽，凌 靜

(南京醫科大學附屬南京市婦幼保健院婦科，南京 210004）

應用實時定量聚合酶鏈式反應（PCR）技術檢測子宮肌瘤組織中的hsa-miR-197表達水平，并與配對正常子宮肌細胞對比。通過miRbase、UCSC、NCBI等在線數據庫獲取并分析hsa-miR-197序列保守性及其基因組特征。選擇miRanda、MirTarget2及TargetScan三個在線數據庫預測hsa-miR-197的靶基因并取交集以便后續分析。通過基因本體（GO）功能注釋、GO富集分析和信號轉導通路富集分析初步闡明，hsamiR-197靶基因參與調控的細胞功能與信號通路。hsa-miR-197的功能較廣泛，參與腫瘤發生的多種生物學過程，提示hsa-miR-197可能與子宮肌瘤的發病機制密切相關。

子宮肌瘤；hsa-miR-197；生物信息學；靶基因

1 前言

子宮肌瘤是育齡期女性最常見的盆腔腫瘤，45歲女性的發病率超過60%，可導致月經過多、盆腔痛、習慣性流產及不孕等一系列臨床癥狀，嚴重威脅女性的身心健康[1]。最近研究表明，miRNAs對子宮肌瘤細胞的增殖、凋亡及受類固醇激素的調控在子宮肌瘤的發病機制中起到重要的作用[2]，研究發現，hsa-miR-197在多種腫瘤中（肝癌、肺癌、胃癌、乳腺癌及子宮肌瘤等）表達具有差異[3～7]。本研究擬探討hsa-miR-197在子宮肌瘤組織中的表達，并通過在線數據庫、運用生物信息學軟件對hsa-miR-197生物學特征以及功能進行預測分析，從而為深入研究hsa-miR-197在子宮肌瘤發生、發展過程中的分子機制提供理論依據和實驗基礎。

2 材料與方法

2.1 臨床樣本

12例子宮肌瘤組織和配對正常子宮肌組織標本來源于南京市婦幼保健院行子宮肌瘤剔除術的患者，年齡為36～49歲，所有患者均無內科合并癥，月經規律，術前3個月內未服用激素類藥物。采取標本均得到患者的同意，并簽署了知情同意書，術后病理學診斷為子宮肌瘤。

2.2 試劑及儀器

miRNeasy總核糖核酸（RNA）抽提試劑盒（德國QIAGEN公司），反轉錄試劑盒，TaqMan MicroRNA Assay，ABI7500熒光定量PCR儀及ABI 7900 PCR儀（美國ABI公司）。

2.3 組織處理及RNA抽提、反轉錄

樣品在離體后應迅速冷凍在液氮中，把組織剪切成約100 mg大小，使液氮迅速滲透到組織內部而防止組織內部的RNA降解；將剪切好的樣品放入勻漿管中加入1 mL TRIzol后用組織勻漿器將其在冰上勻漿3～5 min，轉移至1.5 mL離心管，而后進行RNA抽提。RNA操作中所需玻璃和金屬器材均經過180℃處理2 h；塑料器材均用含0.1%焦碳酸二乙酯（DEPC）的水中浸泡過夜后高壓滅菌；溶液均用DEPC水配制或配制好后用DEPC處理過夜后高壓滅菌，令RNA酶滅活。將離心管中的液體在室溫下放置5 min；加入200 μL氯仿，蓋緊管口，劇烈振蕩 15 s后，靜置2 min；12000×g 4℃離心15 min；吸取上清液于另一Eppendorf離心管中；加入0.5 mL異丙醇，顛倒數次，室溫靜置 10 min；12000×g 4℃離心10 min，可見白色膠樣RNA沉淀；輕輕吸去上清液，加入1 mL 75%乙醇，混勻，漩渦振蕩洗滌，7500×g 4℃離心5 min；吸去上清液后干燥沉淀5～10 min；用50 μL DEPC處理的水重新溶解RNA，必要時55～60℃水浴10 min助于溶解；保存于-80℃。分光光度儀定量選擇OD260/OD280比值為1.9～2.1的RNA樣品，濃度均在1.5μg/μL以上。

按照TaqMan MicroRNA Reverse Transcription Kit說明書加入逆轉錄反應所需試劑，miR-197引物、總RNA等進行反應。逆轉錄條件：16℃、30 min；42℃、30 min；85℃、4 min。將逆轉錄好的cDNA于-20℃貯存備用。

2.4 Real-time PCR

使用探針法檢測miR-197的表達量。使用逆轉錄生成的cDNA作為模版進行qPCR擴增，根據Premix ExTaq試劑盒說明加入premix、TaqMan MicroRNA Assays提供的miR-197探針進行反應。Real-time PCR條件為：95℃、2 min→（95℃、15 s→60℃、30 s）循環40次，采集熒光值。每個樣本均設復孔，并以U6作為內參，獨立實驗重復3次。計算平均CT值，以目的和內參基因為對照，應用相對定量法（ΔΔCT法）進行半定量分析，用2-ΔΔCT值表示目的基因相對對照的miRNA表達量。

2.5 生物信息學分析

筆者通過Pubmed(http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/）查閱已發表的hsa-miR-197相關文獻支持的已有功能。利用miRBase（http：//www.mirbase.org/）、UCSC（http：//genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgGateway）數據庫查找hsa-miR-197堿基序列、染色體定位、物種保守性等基本信息。選擇miRanda（http：//www.microrna.org/）、MirTarget2（http：//mirdb.org/miRDB/）及 TargetScan（http：//www.targetscan.org/）三個主流數據庫預測hsa-miR-197的靶基因，取三者的交集并結合已經證實的靶標基（FUS1），采用BINGO進行GO注釋的顯著性分析[8]。選擇所有蛋白編碼基因作為背景基因，使用超幾何分布計算P值，以P＜0.05為顯著性閾值，得到基因集合相對于背景具有統計意義的注釋，即基因集合在GO類別上的分布信息；選擇DAVID數據庫對hsa-miR-197預測的靶基因集合進行基于京都基因與基因組百科全書（KEGG）的Pathway分析，通過FisherExactTest計算P值，以P＜0.05為顯著性閾值得到基因集合相對背景具有統計意義的信號轉導及疾病通路。

3 結果

3.1 子宮肌瘤組織中miR-197的表達特點

為了確定miR-197在子宮肌瘤組織中的表達異常，筆者從臨床采集了12對不同子宮肌瘤患者的新鮮子宮肌瘤和其配對正常的子宮肌組織，通過Realtime PCR的方法檢測子宮肌瘤組織和子宮肌層組織中miR-197的表達量。如圖1所示，與正常子宮肌組織相比，miR-197的表達在子宮肌瘤組織中顯著降低（P<0.05）。在12例病人中，除去8號病人，其他11例病人子宮肌瘤組織中的miR-197表達水平均明顯低于其在相應子宮肌組織中的表達。上述實驗結果表明，miR-197在子宮肌瘤組織中表達下調，為進一步研究其生物學功能提供了初步依據。

圖1 miR-197在12例子宮肌瘤組織及配對正常子宮肌組織中的相對表達Fig.1 Relative miR-197 expression in the uterine leiomyomas tissues and paired normal myometrium

3.2 hsa-miR-197基因分析

參考NCBI數據庫筆者發現hsa-miR-197基因位于人類1號染色體p13.3區域，基因大小為75 bp，轉錄產物pre-miR-197的序列5′-GGCUGUGCCGGGUAGAGAGGGCAGUGGGAGGUAAG AGCUCUUCACCCUUCACCACCUUCUCCACCCAGCAUGGCC-3′；miRbase數據庫顯示hsa-miR-197基因的序列在多個物種間高度保守，其轉錄成熟體為hsa-miR-197-5p（5′-cggguagaga gggcagugggagg-3′）及 hsa-miR-197-3p（5′-uucaccaccuucuccacccagc-3′）兩個剪切體，其中以hsa-miR-197-3p為主。通過UCSC在線數據庫發現，hsa-miR-197在人、恒河猴、狗、大象等物種間高度保守（見圖2），提示hsa-miR-197具有潛在的重要生物學功能。

圖2 hsa-miR-197保守性分析Fig.2 Conservative analysis of hsa-miR-197

3.3 hsa-miR-197的靶基因預測

MiRanda、MirTarget2及TargetScan預測的靶基因數量分別為7644個、320個和217個，3種數據庫的計算結果取交集，合并已證實的靶標，共獲得75個候選靶基因，部分預測的hsa-miR-197靶基因見表1。

表1 部分預測hsa-miR-197靶基因Table 1 Predicted target-genes of hsa-miR-197

3.4 hsa-miR-197預測靶基因集合的GO注釋分析及信號轉導通路富集分析

功能富集分析預測的結果顯示，hsa-miR-197調控的靶基因功能分別富集在DNA依賴的轉錄調控、突觸傳遞的調控、胚胎器官發育、細胞周期正調控、細胞間通信等生物學過程，部分結果見圖3。

圖3 hsa-miR-197預測靶基因集合的GO分析結果Fig.3 GO analysis of candidate target genes of hsa-miR-197

信號轉導通路富集分析的結果顯示，hsa-miR-197靶基因顯著富集于涉及JAK-STAT、Toll樣受體、Caspase凋亡等信號轉導通路，部分結果見圖4。

圖4 hsa-miR-197靶基因集合的信號轉導通路富集分析結果Fig.4 Pathway analysis of candidate target genes of hsa-miR-197

4 討論

近年來子宮肌瘤的發病率迅速上升，雖然治療技術有了很大的提高，但仍是育齡期婦女子宮切除的重要原因之一。最新研究表明子，子宮是內分泌器官[9]，過早切除會嚴重影響女性健康。迄今為止，人類對子宮肌瘤仍然沒有令人滿意的治療手段，預防并控制其發展是子宮肌瘤治療中尚待解決的問題。

進入新世紀后，腫瘤的基因治療越來越受到人們的關注，也取得了不小的突破與成就。目前的基因治療絕大部分是針對腫瘤發生發展過程中單個目標基因進行干預，以達到治療的效果。但是腫瘤的發生發展涉及多條信號通路與多種關鍵基因蛋白變化，因此針對單獨靶點的基因治療有其明顯的缺陷[10]。MicroRNA(miRNA)的發現與深入研究有望填補這一空白。miRNA是一類長度約22 nt的具有在轉錄后水平調控基因表達的內源性非編碼小分子RNA[11]，通過與mRNA 3′端非翻譯區完全或不完全互補配對從而剪切mRNA或抑制翻譯起始。miRNAs通過調節靶向基因的表達廣泛參與幾乎所有的細胞過程中，因此，miRNAs在發育、細胞增殖、凋亡和分化等重要生物學過程中起重要作用，并與腫瘤發生等人類的疾病密切相關[12]。

已有報道發現，多個miRNAs在子宮平滑肌瘤及子宮肌層組織平滑肌細胞中表達并發揮調節作用[13]。miR-197是miRNA大家族中的一員，近年來的研究表明，miR-197參與多種生物學過程并與多種腫瘤的發生密切相關[3～7]。相關功能研究表明：miR-197在腫瘤發生中細胞增殖與凋亡異常[14]、基因多態性及信號傳遞通路[15]中都有所表現，但miR-197與子宮肌瘤發病機制之間的相關研究未見報道。已有文獻證實，miRNAs在子宮肌瘤細胞與正常子宮肌細胞之間存在差異表達（包括miR-197）[7]，因此，筆者將miR-197作為進一步研究的對象。本文應用實時熒光定量PCR技術檢測組織miR-197的表達，結果證實子宮肌瘤組織和相應子宮肌層組織具有顯著性差異，并呈現出在子宮肌瘤組織中低表達的特征。結果提示，相對于正常子宮肌層組織，miR-197的表達在子宮肌瘤組織中顯著降低，很可能與子宮肌瘤的發生相關。這一結果與國外報道的子宮肌瘤細胞中miR-197的表達較子宮肌細胞顯著下調一致[16]，均提示miR-197很可能參與子宮肌瘤的發生，但具體機制還不清楚，因此首先借助生物信息學在線分析工具對hsa-miR-197進行分析，預測其可能的靶基因，正確認識靶基因之間的相互作用，對具體研究其生物學功能有著重要意義。

鑒于目前實驗鑒定成功的靶向關系遠不能滿足在系統水平上實現對miRNAs相關功能的全面認識。生物信息學的迅速發展為全面研究miRNAs相關功能提供了方便。利用數據庫技術，將miRNAs、靶基因和各種生物信息數據庫連接起來，可以對單個或多個miRNAs的相關功能進行直接預測，為實驗研究提供方向性指導。本研究發現，hsa-miR-197序列在人、恒河猴、狗、大象等物種間具有高度保守性，提示其可能具有較為強大的生物學功能。mi-RNAs既可作為抑癌基因，下調原癌基因的活性；也可作為致癌基因，下調抑癌基因的活性，從而形成錯綜復雜的調控網絡，參與腫瘤的發生發展[17]。最近一些研究證實，hsa-miR-197在多種腫瘤中表達異常，具有抑癌基因的作用，與腫瘤細胞增殖、侵襲、遷移和凋亡密切相關，對于腫瘤的診斷、治療和預后具有十分重大的意義[18]。miRanda、MirTarget2及TargetScan是目前信息學中應用較廣泛的miRNA靶基因預測在線軟件。miRanda是最早的一種預測算法，有較好的檢出率，預測的靶基因數量較多，但假陽性率也較高，在miRanda數據庫中檢索出hsamiR-197有7644個靶基因。TargetScan和PicTar作為第二代預測算法，其預測靶基因的數量相對減少，但同時也增加了預測的精確度，降低了假陽性率[19]，利用這兩個數據庫預測的hsa-miR-197靶基因分別為320個和217個。雖然這3種不同的軟件預測的結果不一樣，但同時采用這3種預測算法進行預測，然后取其交集部分（共75個靶基因），就能提高預測結果的可靠性，減少假陽性率。

本研究針對3個數據庫的預測結果，采用生物信息學方法對基因集合進行GO功能注釋、GO富集分析和信號轉導通路富集分析，多層次、多角度對hsa-miR-197的預測基因進行描述。筆者發現hsamiR-197靶基因的功能主要涉及DNA依賴的轉錄調控、突觸傳遞的調控、細胞周期正調控、細胞間通信等與腫瘤發生密切相關的生物學過程（P＜0.05）；同時，信號通路富集分析發現miR-197的靶基因主要參與JAK-STAT、Toll樣受體、Caspase凋亡等信號轉導通路（P＜0.05）。由于這些生物學功能涉及腫瘤發生發展的多個階段，據此可推測hsa-miR-197在多種腫瘤中表達異常，并通過調控其靶基因的表達引起多種生物學特征的變化。本次研究對hsamiR-197在子宮肌瘤組織中的表達進行了驗證，并采用生物信息學方法對hsa-miR-197生物學特性及其功能進行初步分析，擬通過實驗進一步認識子宮肌瘤的發病機制和對mi-RNAs異常表達識別，從而定義其自身的功能和治療靶點，為子宮肌瘤的診斷、治療和預后提供理論依據和試驗基礎。

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The expression mode of hsa-miR-197 in uterine leiomyomas tissue and related bioinformatics analysis

Xu Qing，Fu Ziyi，Wu Xiaoli，Huangfu Yushuang，Ling Jing

(Gynecology of Affiliated Nanjing Maternal and Child Health Hospital，Nanjing Medical University，Nanjing 210004，China)

We performed Real-time PCR to detect the hsa-miR-197 expression levels in uterine leiomyomas tissues and paired normal myometrium separately；online databases including miRbase，UCSC，NCBI are employed to analysis the sequence conservation and genetic characteristics of hsa-miR-197；miRNA databases such as miRanda，MirTarget2 and TargetScan are chosen to predict hsa-miR-197 target genes；meanwhile，the intersection genes of these miRNA databases are chosen，and GO and Pathway analysis of these genes are carried out to explore the potential role of hsa-miR-197 playing in regulating the uterine leiomyomas occurrence and development.hsa-miR-197 functions in broad ground and participates in uterine leiomyomas multiple biology progress，which indicates that hsa-miR-197 could regulate uterine leiomyomas occurrence and development.

uterine leiomyomas；hsa-miR-197；bioinformatics analysis；target genes

R169

A

1009-1742（2014）05-0099-06

2014-04-03

國家自然科學基金青年科學基金項目（81202042）；南京市衛生局科技發展項目（QRX11212）

徐 青，1979年出生，女，浙江上虞市人，主治醫師，研究方向為婦科腫瘤；E-mail：xq079054@163.com