痛情緒反應量化方法的探索*

張肖怡蘭坤馮曉璞宋瑞瑞張策張宇

痛情緒反應量化方法的探索*

張肖怡①蘭坤②馮曉璞①宋瑞瑞③張策①張宇①

目的：在經典的formalin誘導的條件位置回避模型的基礎上，結合本實驗室條件探索一種新的痛情緒測量。方法：完全弗氏佐劑（CFA）誘導的條件性位置回避。方法：雄性SD大鼠左側足底皮下注射完全弗氏佐劑，建立條件性位置回避（CPA）模型。結果：SD大鼠足底皮下注射CFA會引起持續的炎性疼痛，可以產生穩定的條件性位置回避。足底注射生理鹽水（NS）組和空白對照（naive）組不能產生條件性位置回避。結論：CFA誘導的CPA模型可以作為痛情緒量化的一種方法。

完全弗氏佐劑； 條件性位置回避； 持續性炎性痛； 痛情緒； 大鼠

國際疼痛研究學會（IASP）曾定義“疼痛是一種與組織損傷或潛在的損傷相關的不愉快的主觀感覺和情緒體驗”。說明疼痛包含兩種成分：即痛的感覺分辨（sensory discrimination）和痛的情緒反應（affective dimensions）。前者主要編碼和感受刺激的屬性，包括刺激的性質、強度、位置等；后者指痛的情緒、情感特性，涉及編碼傷害性刺激所引發的厭惡、焦慮、恐懼等負性情緒。在過去的幾十年中，對痛感覺成分的研究在整體、細胞、分子和基因等各個層次上獲得了大量成果，針對這些成果也設計成許多新藥，但大都療效有限，往往還產生較大的副作用。一些報道表明，慢性疼痛常常伴有患者的情緒障礙，如孤獨、恐懼、焦慮、甚至厭世等給患者帶來的身心傷害遠比疼痛本身更為嚴重，也受到了研究者的廣泛關注[1-3]。這說明痛情緒反應在慢性持續性疼痛過程中起著非常重要的作用。但對于痛情緒的研究，由于實驗方法和動物模型的限制，進展十分有限。

2001年，Johansen等[4]采用條件性位置回避裝置最早在嚙齒類動物上分離出了行為意義上的痛情緒。此后學者們也越來越多的采用條件性位置回避裝置（conditioned place avoidance，CPA）來衡量和量化痛情緒。在國內，Gao等[5]根據Johansen等[4]的研究成功復制了formalin誘導的條件性位置回避模型，多數采用4～6 d的訓練方法。除了formalin被用作疼痛模型的致痛物質外，完全弗氏佐劑（Complete Freund’s adjuvant，CFA）也常被用在持續性炎性疼痛的模型中。筆者實驗室根據前者formalin誘導的條件位置回避模型研究的經驗，建立了簡便、有效，實驗周期更短的CFA誘導的條件位置回避模型。

CFA是一種油包水的乳濁液，能夠非常有效地誘導產生高滴度的抗體。它含結核分枝桿菌的細胞壁成分，可以加強對抗原的抗體反應。佐劑活性來自于油滴中免疫原的持續釋放，并刺激局部免疫反應，注射入哺乳動物皮下之后，會產生炎癥和疼痛。大鼠足底注射CFA是一個被廣泛應用的慢性炎性痛模型，進行炎性痛相關機理的基礎研究[6]。在注射CFA后，動物局部會出現較長時間的紅、腫、熱、痛等炎癥反應以及對熱刺激或機械刺激反應敏感的特征。根據相關文獻[6-7]和本實驗之前的研究發現，CFA導致的熱痛敏的高峰出現在注射后2～6 h，并持續約1～2周左右，是種良好的持續性炎性痛模型。因此，筆者考慮把CFA慢性痛模型和條件位置回避結合起來，建立完全弗氏佐劑誘導的條件性位置回避模型。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及分組 選取21只雄性Sprague-Dawley （SD）大鼠，重量250～270 g，均由山西醫科大學實驗動物中心提供。大鼠分籠飼養于動物房內，室溫控制在（22±1）℃，12～12 hrs晝夜循環光照。正式實驗開始前3～5 d大鼠先初步適應實驗室環境。將所有大鼠分為空白對照組（naive）6只、足底皮下注射生理鹽水組（NS）7只和足底注射CFA組（CFA）8只，各組大鼠的一般資料比較差異無統計學意義（P＞0.05），具有可比性。

1.2 試劑和藥品 完全弗氏佐劑（sigma）和生理鹽水1：1混合試劑

1.3 實驗儀器和設備 筆者結合以往的研究及本實驗室的條件，改進出條件位置回避的裝置[8-10]。如圖1所示，具體裝置為一有機玻璃材質的長盒（長60 cm，寬15 cm，高25 cm），平均分為兩個室，中間用可抽取的有機玻璃材質的門阻隔。一個室外三面貼有間隔一致紅色水平條帶，底部為3 mm×3 mm孔徑的鋼絲網眼；另一個室外三面貼有間隔一致的藍色垂直條帶，底部為6 mm×6 mm孔徑的鋼絲網眼；中間的隔板門分別貼有同側隔室一致的條紋，貼有藍色垂直條紋的室外掛有一個小LED燈，亮度為能夠使同側的隔室有微弱的亮光，這樣建立的兩個相對獨立的環境讓大鼠在視覺和觸覺上會有明顯差別，但不會使大鼠出現明顯的環境偏好。整個裝置放在比較安靜、光線暗的環境中，遠離裝置1 m遠處有個15 W的燈，保持環境光線的穩定。在裝置的頂部裝有紅外攝像頭，與外部的電腦相連，這樣可以記錄大鼠在實驗階段的運動情況。完成后電腦系統自動可以分析大鼠在兩側裝置中停留的時間。

其中兩室隨機作為“疼痛環境”適應區和“非痛環境”適應區，中間的擋板可抽取。

1.4 實驗設計 由CPA誘導的條件位置回避實驗過程分為3 d。

1.4.1 第1天 Pre-conditioning Day將裝置中間的隔板取出，讓大鼠在裝置中自由活動10 min，分別記錄大鼠在兩室中停留的時間。

圖1 條件位置回避裝置

1.4.2 第2天 Conditioning Day將裝置中間隔板插入，將整個裝置分隔成兩個相對獨立的室，將大鼠任意放入其中一個室中，為“非痛環境”適應區，自由活動30 min。之后將大鼠取出放回飼養籠，30 min后給大鼠左側足底皮下注射0.08 mL的CFA，其中CFA和生理鹽水1：1混合均勻。2 h后，將大鼠放入另外一個室，為“疼痛環境”適應區。在自由活動30 min后，把大鼠取出，放回飼養籠。

1.4.3 第3天 Post-conditioning Day裝置中間隔板取出，大鼠在裝置中自由活動10 min，分別記錄大鼠在兩室中停留的時間。

在實驗過程中，每次實驗結束后用75%的酒精擦洗整個裝置。如果大鼠第3天在“痛環境”匹配室所停留的時間少于第1天在該室停留的時間，且有統計學差異，則說明大鼠產生了條件性位置回避（CPA），也說明CFA誘導的條件性位置回避模型成功建立。用大鼠第3天在“痛環境”停留的時間減去第1天在該室停留的時間，其差值稱為回避分數（CPA Score），其數值的絕對值大小代表了CPA的程度，回避分數越大，表示回避程度越大，證明痛情緒越明顯。

1.5 統計學處理 采用GraphPad Prism 5軟件對數據進行分析和作圖，計量資料用（±s）表示，大鼠在“痛環境”匹配室的前后停留時間時間進行配對t檢驗，組間比較進行非配對t檢驗，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

空白對照組和足底注射NS組大鼠第3天在“疼痛環境”匹配室的時間與第1天比較差異均無統計學意義（P＞0.05）；足底注射CFA后，大鼠第3天在“疼痛環境”匹配室的時間明顯少于第1天，差異有統計學意義（P＜0.05），對“疼痛環境”產生了厭惡反應，見表1、圖2。空白對照組和足底注射NS組的回避分數比較差異均無統計學意義（P＞0.05），而足底注射CFA組的回避分數明顯大于其他兩組，差異均有統計學意義（P＜0.05），見圖3。

表1 各組大鼠在“疼痛環境”匹配室前后停留時間的比較（±s）s

表1 各組大鼠在“疼痛環境”匹配室前后停留時間的比較（±s）s

*與Pre-conditioning比較，P＜0.05

組別 Pre-conditioning Post-conditioning空白對照組（n=6） 286.1±38.62 297.6±75.02足底皮下注射生理鹽水組（n=7） 301.6±76.4 291.34±109.8足底注射CFA組（n=8） 304.1±39.8 156.5±80.2*

圖2 各組大鼠在“疼痛環境”匹配室前后停留時間比較

圖3 各組大鼠回避分數比較

3 討論

隨著現代臨床醫學的發展，人們越來越重視生存質量的提升。然而，各種疾病往往都伴隨著疼痛的產生，目前疼痛已經成為繼呼吸、脈搏、血壓、體溫4大生命體征之后的第5大生命體征。眾所周知，疼痛包括對痛刺激的主觀感覺和情緒體驗。臨床上的觀察顯示，疼痛的負性情緒給患者帶來的痛苦遠遠大于痛刺激本身，因此，疼痛所帶來的負性情緒的發生機制和緩解方法受到學者們的廣泛關注[1-3]。例如，Rainville等[11]采用催眠暗示法發現，在痛刺激強度不變的情況下，隨著受試者被暗示刺激強度升高，其不愉快程度也升高，與此同時前扣帶皮層（anterior cingulated cortex，

ACC）的興奮程度隨之增強。2001年，Johansen等[4]指出吻側ACC是與痛情緒高度相關的大腦皮層。也有研究表明，ACC內N-甲基-D-天冬氨酸（N-methyl-D-aspartic acid receptor，NMDA）受體依賴的細胞外信號調節激酶-cAMP反應元件結合蛋白（extracellular signal regulated kinase-cAMP response element binding protein，ERK-CREB）信號通路參與了大鼠痛厭惡情緒的形成[5，12-14]。筆者實驗室前期的研究表明，電針可以緩解疼痛中的情緒部分。

疼痛會引起情緒情感的反應過去早有發現，但苦于一直沒有很好的動物模型進行更深入的研究。Johansen等[4]采用formalin誘導產生的條件化位置回避裝置最早在嚙齒類動物上分離出了行為意義上的痛情緒，為此類研究提供了新的方法和思路。該方法利用大鼠足底皮下注射formalin，誘導出F-CPA行為反應，說明formalin的刺激使大鼠記住了發生疼痛時的環境并因此而對“痛環境”產生了厭惡情緒。現有許多學者沿用或改進了這樣的方法來研究痛情緒反應。張玉秋教授的實驗室等根據Johansen等[4]的研究，結合實際情況復制出了福爾馬林誘導的條件性位置回避模型，實驗結果也比較穩定。福爾馬林是甲醛的水溶液，誘導一個雙時相的疼痛反應，第一時相（早時相）反應在注射后立即出現，持續數分鐘，第二時相（晚時相）經過一個潛伏期，可持續數10 min左右[15]。同時根據相同的原理，也設計出了由激光誘導的條件性位置回避、由電擊誘導的條件性位置回避模型和由高滲鹽水誘導的條件性位置回避模型，都取得了不錯的效果[16-17]。

筆者采用完全弗氏佐劑（CFA）來誘導產生類似的逃避行為，主要是因為CFA作為在疼痛研究中常被使用的炎性致痛物質，能在注射部位局部產生明顯、持續時間較長的炎性反應，后者能引起大鼠痛敏，其高峰出現在注射后2～6 h，并持續約2周左右，將痛敏高峰與環境加以耦合，這樣可以很好地模擬出炎性疼痛對環境產生的厭惡表現，即對痛環境的逃避[6-7]。根據上述的研究結果，筆者發現足底注射完全弗氏佐劑可以很好地產生條件性位置回避，而且與formalin或其他模型比較，縮短了實驗周期，也便于實驗者進行操作。這為利用動物模型對痛情緒展開更深入的研究提供了又一種簡便、易行的新選擇。

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Exploration of Pain Emotional Response Quantization Method

/ZHANG Xiao-yi，LAN Kun，FENG Xiaopu，et al.//Medical Innovation of China，2014，11（18）：045-048

Objective：To explore a new method for measuring pain mood：Complete Freund’s adjuvant（CFA）-induced CPA model to measure affective dimension of pain，based on the classical formalin of conditioned place avoidance （F-CPA） model and our laboratory conditions.Method：The male Sprague-Dawley （SD） rats’ left hind paw were given hypodermic injection the CFA，successfully established CFA induced CPA model in rat.Result：Compared with the injection of normal saline（NS） group and blank control group，intra-plantar injection of CFA induced persistence inflammatory pain and stabile CPA.Conclusion：CFA-induced CPA model in rat can be a method of reflecting painrelated negative emotion.

Complete Freund’s adjuvant； Conditioned place avoidance； Persistence inflammatory pain；Affective dimension of pain； Rat

10.3969/j.issn.1674-4985.2014.18.015

2014-04-11） （本文編輯：歐麗）

國家自然科學基金資助項目（81371254）

①山西醫科大學生理學系 山西 太原 030001

②山西醫科大學醫學影像系

③山西醫科大學第一臨床醫學院

張策 張宇

First-author’s address：Department of Physiology in Shanxi Medical University，Taiyuan 030001，China