EMT與非EMT細胞在大腸癌侵襲轉移中的作用

王雅娟，胡 潔，趙海燕，韓慧霞

(南方醫科大學病理學系，廣東廣州510515)

上皮細胞間質轉化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)與非EMT 細胞是共同完成自發轉移的過程，由EMT 細胞負責降解細胞周圍的基質，為非EMT 細胞鋪平了侵襲轉移的道路［1］。此觀點與以往認為的發生EMT 的腫瘤細胞，其侵襲性比非EMT細胞強有不同之處。那么在大腸癌中發生EMT 的細胞與非EMT 細胞之間是否也存在這樣的協同合作關系呢?本實驗使用轉化生長因子-β1(TGF-β1)長期誘導大腸癌HT29 細胞使之發生EMT，將EMT與非EMT 的細胞混合培養，探討兩者在轉移過程中是否存在協同關系。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

TGF-β1(Peprotec 公司);RPMI1640 培養基(萊德爾生物公司);新生牛血清(吉泰公司);Trizol 試劑(南京凱基公司);反轉錄(Reverse Transcription System)試劑盒和熒光定量(SYBR Premix ExTaqTM)試劑盒(TaKaRa 公司);E-鈣黏素(Ecadherin)、波形蛋白(Vimentin)和GAPDH 引物(上海英駿公司合成)。綠色熒光蛋白質粒(GFP)和紅色熒光蛋白質粒(RFP)(Santa Cruz 公司)。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養:人大腸癌細胞系HT29 為本室冷凍保存;采用含20%新生牛血清的RPMI1640 培養基，至37 ℃、5% CO2培養箱內培養。用10－5g/L濃度的TGF-β1 連續刺激HT29 細胞［2-3］。

1.2.2 RT-PCR 檢測:10－5g/L TGF-β1 連續刺激10 d后HT29 中Ecadherin 和Vimentin 的表達

1)RNA 的提取:參照說明書，用Trizol 試劑常規提取細胞總RNA。

2)cDNA 第1 鏈的合成:按照反轉錄試劑盒操作程序進行反轉錄反應。反應總體系為20 μL，其中樣品總RNA 2 μL，5 × PrimeScript 4 μL，Prime-ScriptTMRT Enzyme Mix Ⅰ1 μL，Random 6 mers 1 μL，Oligo dT Primer 1 μL，DEPC 水11 μL。37 ℃反應15 min，85 ℃滅活5 s。

3)Real-time PCR:看家基因GAPDH 為內對照。通過相對熒光定量PCR 方法，同時對Ecadherin、Vimentin和GAPDH 進行檢測，計算出不同樣本的Ecadherin、Vimentin 的相對表達量(表1)。

表1 Ecadherin、Vimentin和GAPDH 基因引物序列Table 1 Primer sequence of Ecadherin，Vimentin and GAPDH length(bp)

應用Mx7500P 定量PCR 儀進行real-time PCR實驗，反應條件為95 ℃5 s，60 ℃20 s，72 ℃10 s，40 個循環，熒光信號監測。以Folds =2－ΔΔCt表示實驗組與對照組目的基因表達的倍數比關系，公式如下2－ΔΔCt=［Ct(target gene)－Ct(GAPDH)］實驗組－［Ct(target gene)－Ct(GAPDH)］對照組［4］。重復3 次實驗，計算平均值，Ct 值越小，表示起始拷貝數越多。

1.2.3 觀察細胞形態:用10－5g/L 濃度的TGF-β1連續刺激HT29 細胞40 d 后，光鏡觀察細胞形態。首先制作細胞爬片，PBS 洗滌3 次，95%乙醇固定10 min后PBS 洗滌3 次，常規蘇木素，伊紅染色，逐級乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹脂封片。

1.2.4 考馬斯亮藍染色觀察刺激40 d 后HT29 細胞骨架:培養細胞爬片，PBS 洗滌3 次，每次5 min，95%乙醇固定10 min 后PBS 洗滌3 次，4 min/次，1.5%Triton 振蕩洗滌3 次，8 min/次，PBS 洗滌3 次，5 min/次，考馬斯亮藍染液染色40 min，PBS 洗去多余的染液，空氣干燥，二甲苯透明，中性樹脂封片。

1.2.5 細胞的劃痕實驗:將細胞接種于24 孔培養板中，形成細胞單層，培養20 h 后用10 μL 移液器滴頭沿培養板底部呈“一”字型劃痕單層培養細胞，顯微鏡下記錄劃痕區相對距離，繼續培養48 或72 h，倒置顯微鏡下觀察并照相記錄。

1.2.6 熒光標記EMT 細胞和非EMT 化細胞遷移實驗:RFP 轉染刺激前HT29 細胞，GFP 轉染刺激后HT29 細胞。轉染前1 天將細胞接種至24 孔板中，細胞1 ×105個/孔，培養24 h 后使細胞鋪滿瓶壁生長。轉染前用不含血清的RPMI1640 培養基沖洗細胞兩遍后，加入轉染試劑，至37 ℃、5%CO2培養箱內培養。4 h 后更換完全培養基。24 h后熒光顯微鏡觀察轉染效率。轉染20 h 后，直接用自然力分別吹打兩種細胞，使細胞脫落，將兩種細胞混合培養。

1.3 統計學分析

采用SPSS13.0 統計軟件進行處理，實時熒光定量PCR 檢測TGF-β1 刺激HT29 細胞前后的Ecadherin、Vimentin 的mRNA 表達水平均采用兩樣本t 檢驗的統計學方法。

2 結果

2.1 TGF-β1 連續刺激10 d 后HT29 中Ecadherin和Vimentin mRNA 的表達

2.1.1 總RNA 的提取:電泳檢測有3 條清晰的rRNA 帶，28S，18S 和5S，說明RNA 無降解(圖1)。

2.1.2 統計學分析:HT29 經10－5g/L TGF-β1 連續刺激10 d 后，Ecadherin Ct 值由4.77 ±0.16 變為5.57 ±0.44，表達顯著下降(P＜0.05);Vimentin Ct 值由14.96±0.32 變為14.05 ±0.23，表達顯著上調(P＜0.05)。

2.2 光鏡下觀察經TGF-β1 連續刺激40 d 后的HT29 細胞

刺激前的HT29 細胞呈橢圓形，匯合性生長，細胞間的黏附作用強;刺激后的細胞形態較之前變梭，生長較分散，細胞之間的連接不緊密(圖2)。

圖1 細胞總RNA 瓊脂糖凝膠電泳Fig 1 Agrose gel electrophoresis of total RNA from colorectal cancer cell lines

圖2 細胞HE 染色Fig 2 Cell morphology(HE×400)

2.3 光鏡和考馬斯亮藍染色觀察經TGF-β1 連續刺激后的HT29 細胞

刺激后的HT29 細胞藍色絲網狀結構的骨架蛋白明顯增多，相鄰細胞間骨架連接不如刺激前緊密(圖3)。

2.4 劃痕實驗結果

HT29 細胞成匯合生長，遷移速度不及刺激后的HT29 細胞，兩者混合培養后，混合細胞的遷移速度比HT29 快，但比刺激后的HT29 細胞稍慢，在遷移速度較快的細胞中圓形和梭形的細胞均能見到(圖4)。

2.5 熒光標記EMT 細胞和非EMT 化細胞遷移實驗

自然力吹打細胞混合培養，劃痕48 h 后見紅、綠色細胞分布均勻(圖5)。

圖3 細胞考馬斯亮藍染色Fig 3 Observation of cytoskeletal protein by Coomassie blue staining(×400)

圖4 劃痕實驗Fig 4 Scratches test

圖5 劃痕后48 h 混合培養的細胞Fig 5 Co-culturing two kind of cells，scratches，after 48 hours(×100)

3 討論

TGF-β1 是一種誘導大腸癌細胞發生EMT 的微環境細胞因子，能引起腫瘤細胞的形態、運動和侵襲能力的改變［5］。HT29 細胞來源于人大腸癌原發灶，在前期實驗中，本研究發現HT29 的上皮標志E-cadherin表達很高，間質標志Vimentin 幾乎不表達，具有上皮細胞的特征，因此本研究中使用TGF-β1連續刺激HT29 細胞，使之發生EMT。文獻報道發生EMT 的細胞喪失上皮表型的同時獲得間質表型［6-7］。本實驗中經過TGF-β1 刺激后的HT29 細胞Ecadherin表達下降，Vimentin 表達上調。隨后的形態學觀察，發現刺激后的細胞較未刺激的細胞變梭，生長較分散;并且刺激后的細胞骨架蛋白明顯增多，相鄰細胞連接不如刺激前緊密，說明細胞間相互作用減少，遷移和運動能力增強。以上實驗結果均說明HT29 在使用TGF-β1 連續刺激后，發生了EMT。

EMT 可導致大腸癌細胞侵襲力增強［7-11］。有文獻報道當將EMT 化和非EMT 化的腫瘤細胞混合皮下注射到鼠體內成瘤時，兩種細胞都能滲入到血管中，非EMT 化的細胞轉移到了肺組織。認為EMT 化與非EMT 化的細胞共同完成了轉移，EMT 化細胞通過降解細胞周圍基質和血管壁，為非EMT 化細胞的侵襲轉移鋪平道路。此觀點與以往所認為的EMT 化的腫瘤細胞，其遷移能力強于非EMT 化的細胞有不同之處［1］。

本研究將EMT 化與非EMT 化的細胞混合培養，發現混合后細胞的遷移速度比非EMT 化細胞快，但比EMT 化細胞慢，在遷移較快的細胞中不單能見到梭形的EMT 化細胞，也能見到偏圓形的非EMT 化細胞。說明EMT 化與非EMT 化的細胞在腫瘤轉移中可互相影響。隨后將紅色和綠色熒光蛋白質粒分別轉染非EMT 化和EMT 化的細胞后，混合培養兩種轉染后的細胞進行劃痕實驗。由于兩種細胞的發光數量較少，無法顯示所有細胞的運動狀態進而精確定位，但觀察到遷移較快的細胞中兩種細胞均有，表明當有EMT 化的腫瘤細胞存在時，有利于非EMT 化的腫瘤細胞遷移。推測TGF-β1 刺激HT29 發生EMT 后，其可能通過某種途徑改變周圍的環境，以利于腫瘤細胞，包括非EMT 化細胞的侵襲轉移，又或是因為混合培養后EMT 化與非EMT化的細胞之間有連接，EMT 化細胞“拖動”非EMT化細胞運動。但具體的機制還需要進一步研究探討。

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