microRNA- 34c調控c-Met抑制肝細胞癌的發生發展

于曉劍，王 燕，李瑞峰，李 莉，劉玉剛

(山東大學 醫學院 病理學與病理生理學研究所，山東 濟南 250012)

研究論文

microRNA- 34c調控c-Met抑制肝細胞癌的發生發展

于曉劍，王 燕，李瑞峰，李 莉，劉玉剛*

(山東大學 醫學院 病理學與病理生理學研究所，山東 濟南 250012)

目的探討 microRNA- 34c及其靶基因c-Met在原發性肝癌發生發展中的作用。方法熒光定量PCR及Western blot分別檢測人的肝癌組織及癌旁組織中 microRNA- 34c與c-Met蛋白的表達、細胞系HepG2.2.15轉染 microRNA- 34c后c-Met mRNA 及蛋白的表達、細胞系HepG2.2.15轉染microRNA- 34c或c-Met干擾RNA后P53蛋白的表達。建立裸鼠成瘤模型并進行瘤內注射治療，測量計算腫瘤體積。結果microRNA- 34c在人的肝癌組織中表達比癌旁組織明顯降低(P<0.01)，c-Met在肝癌組織中表達較癌旁組織升高。HepG2.2.15細胞系中轉染microRNA- 34c后c-Met表達降低(P<0.01)。HepG2.2.15細胞系中轉染microRNA- 34c及c-Met干擾RNA后P53表達升高(P<0.05)。成瘤裸鼠經microRNA- 34c質粒瘤內注射后腫瘤體積較對照組明顯減小(P<0.05)。結論microRNA- 34c可能通過調節其靶基因c-Met的表達抑制原發性肝癌的發生和發展。

原發性肝癌；微小RNA- 34c；肝細胞生長因子受體；P53

肝細胞肝癌是最常見的惡性腫瘤之一，并且是世界上腫瘤相關的第三大死因[1]。乙肝病毒感染是肝細胞肝癌發生的重要原因。由于缺少早期的診斷手段，肝細胞肝癌的死亡率高，威脅著人類健康[2]。

microRNA是一種由21～25個核苷酸組成的非編碼微小RNA，microRNA可以通過與某些mRNAs接合來影響其翻譯過程從而發揮調節某些基因的作用[3]。近年來研究發現，microRNA可以通過調節其靶基因來影響腫瘤的發生與發展[4]。其中，microRNAc- 34是一類重要的抑制腫瘤發生發展的microRNA家族，其在多種腫瘤組織中表達下降。microRNAc- 34家族被認為是P53的直接調節靶點，上調microRNAc- 34可以導致細胞凋亡和細胞周期阻滯[5]。目前，microRNA- 34c有關的研究相對較少，有報道稱，microRNA- 34c與干細胞肝癌的的發生與發展有關[6]。本研究探討 microRNA- 34c調控c-Met在肝細胞肝癌發生發展中的作用。

1 材料與方法

1.1 材料

10組臨床標本取自在山東省省立醫院肝膽外科行肝癌切除術患者。HepG2.2.15細胞系為山東大學醫學院免疫學研究所惠贈。SPF級BALB/C-nu/nu裸鼠，雄性，4～6周齡，體質量17～20 g[北京華阜康生物科技股份有限公司，合格證號：SCXK(京)2009- 0004]

1.2 主要試劑

miRNA合成及定量試劑盒(Invitrogen公司)；兔抗人c-Met、P53單克隆抗體(Abcam公司)；抗Tubulin、β-actin鼠單克隆抗體(北京康為世紀生物科技有限公司)；辣根酶標記山羊抗兔、抗鼠IgG(北京中杉金橋生物技術有限公司)；SYBR Green Realtime Pcr Master Mix、cDNA第一鏈合成試劑盒(Toyobo公司)；RNA提取Trizol、轉染試劑Lipofectamine2000(Invitrogen公司)；c-Met干擾RNA(上海吉瑪制藥技術有限公司)；BCA蛋白濃度測定試劑盒(江蘇碧云天生物技術研究所)；microRNA- 34c質粒為本實驗室保存，實驗PCR引物均由上海華大基因提供。

1.3 方法

1.3.1 熒光定量PCR檢測臨床組織標本中microRNA- 34c的表達：Trizol法提取肝癌組織及癌旁組織總RNA，按說明書反轉錄為cDNA，并進行熒光定量PCR，反應條件為50 ℃ 2 min, 95 ℃ 2 min，95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，40個循環，U6為內參。實驗結果由2-ΔΔCT公式計算熒光相對計量。

1.3.2 Western blot檢測臨床組織中c-Met蛋白的表達：RIPA/PMSF法提取肝癌組織及癌旁組織總蛋白，用BCA試劑盒檢測所提蛋白濃度后，取40 μg 變性后的蛋白上樣，進行SDS-PAGE凝膠電泳，然后電轉至硝酸纖維素膜上，用5%脫脂牛奶封閉1 h，與c-Met一抗反應4 ℃過夜，TBST洗過后與山羊抗兔二抗反應1 h，TBST洗過后在伯樂ChemiDoc XRS+system顯色。

1.3.3 熒光定量PCR及Western blot分別檢測細胞系HepG2.2.15轉染microRNA- 34c后c-Met mRNA及蛋白的表達：實驗分為pS-microRNA- 34c組，陰性對照pS-control組和空白對照mock組3組。復蘇細胞，于轉染前24 h將細胞以3×105個/孔接種于6孔板中，每孔加入2 mL DMEM培養基，細胞生長至對數期時每孔加入2 mL optiMEM培養基，10 μL Lipofectamine2000及4 μg microRNA- 34c質?；蚩召|粒，6 h后換為10%胎牛血清的DMEM培養基，24 h后Trizol法提取轉染細胞的總RNA。按說明書合成cDNA，并進行熒光定量PCR反應，反應條件為95 ℃ 30 s, 95 ℃ 5 s，55 ℃ 15 s，75 ℃ 30 s，40個循環，GAPDH為內參。c-Met上游引物：5′-C AGGCAGTGCAGCATGTAGT-3′，下游引物：5′-GATG ATTCCCTCGGTCAGAA-3′，GAPDH上游引物：5′-AG AAGGCTGGGGCTCATTTG-3′，下游引物：5′-AGGGG CCATCCACAGTCTTC-3′。實驗結果由2-ΔΔCT公式計算熒光相對計量。重復上述細胞及轉染步驟，轉染后48 h提取轉染細胞的總蛋白。蛋白的提取及檢測方法如上所述。

1.3.4 Western blot檢測細胞系HepG2.2.15轉染microRNA- 34c及c-Met干擾RNA后P53蛋白的表達：實驗分為microRNA- 34c組，c-Met siRNA組，空白對照組。c-Met siRNA序列：sense 5′-GCCUGAAU GAUGACAUUCUTT-3′,antisense 5′-AGAAUGUCAUC AUUCAGGCTT-3′。細胞培養及轉染方法如上所述，每孔加入5 μL Lipofectamine2000及100 pmol c-Met siRNA或4 μg microRNA- 34c質粒。轉染48 h后提取總蛋白并檢測，方法如上。

1.3.5 裸鼠肝癌移植腫瘤模型的建立及瘤內注射：培養Hepg2.2.15細胞，胰蛋白酶消化后，PBS稀釋為1×107/mL單細胞懸液，經錐蟲藍檢測細胞活性大于95%備用。向裸鼠項背部皮下注射0.2 mL備用細胞懸液，14 d后形成肝癌移植腫瘤。將成瘤鼠分為3組，每組6只，從成瘤第5天開始，每兩天分別瘤內注射200 μL含pS-microRNA- 34c，pS-control及OPTI-MEM 100 μL的Lipofectamine2000質?；鞈乙海委?4 d后處死成瘤鼠，取移植腫瘤組織測量，按V=LxI2×0.5公式計算腫瘤體積，L為腫瘤長徑，I為腫瘤寬徑。

1.4 統計學分析

2 結果

2.1肝癌組織中microRNA-34c表達較癌旁組織明顯下降

10組臨床收集的肝癌組織與癌旁組織比較，9例肝癌組織中microRNA- 34c表達量分別降低為為相應癌旁組織的0.196～0.683倍，1例肝癌組織表達升高為1.137倍(圖1)。與10例癌旁組織比較，肝癌組織中microRNA- 34c表達下降(P<0.01)。

圖1 臨床肝癌組織與相應癌旁組織中microRNA- 34c的表達Fig 1 The expression of microRNA- 34c in clinical liver cancer tissues and related normal tissues

2.2 肝癌組織中c-Met表達較癌旁組織明顯上升

10組肝癌組織與癌旁組織比較，7例肝癌組織中c-Met蛋白表達升高(圖2)。microRNA靶基因數據庫及臨床肝癌組織中microRNA- 34c與c-Met表達量的負相關提示，microRNA- 34c可能調控c-Met的表達。

2.3Hepg2.2.15細胞系轉染microRNA-34c后c-Met表達下降

與對照組比較，microRNA- 34c轉染組c-Met在mRNA水平下降為0.356倍(P<0.01)(圖3A)。Mock組蛋白的表達為0.88±0.01, control組蛋白的表達為0.84±0.02，microRNA- 34c組蛋白的表達為0.31±0.01，較mock組及control組明顯減少(P<0.01)(圖3B)。

2.4Hepg2.2.15細胞系轉染microRNA-34c,c-Met干擾RNA后P53表達升高

Mock組蛋白的表達為0.27±0.01，microRNA- 34c轉染組蛋白表達為0.69±0.02，c-Met干擾RNA轉染組蛋白表達為0.63±0.02，與mock組比較，microRNA- 34c及c-Met干擾RNA組P53表達均增高(P<0.05)(圖4)。

2.5 microRNA- 34c在體內抑制肝癌的生長

裸鼠成瘤及瘤內注射14 d后，pS-microRNA- 34c組移植腫瘤體積為289±36 mm3，顯著低于pS-control組和OPTI-MEM組的674±49 mm3和698±57 mm3(P<0.05)(圖5)。

3 討論

肝細胞肝癌是最長見的惡性腫瘤之一，與其他腫瘤相比，肝細胞肝癌死亡率在世界范圍內位居第三，而在中國位居第二，其五年生存率不足5%[7]。目前，肝細胞肝癌的診療手段還十分有限，而分子靶向治療是當前肝細胞肝癌領域研究的熱點。microRNA作為一種自身產生的非編碼微小RNA，可以通過調控其靶基因參與細胞分化、細胞增殖及細胞凋亡等病理生理過程[8]。microRNAc- 34家族可能在多種腫瘤的發生發展過程中發揮了抑癌基因的作用，這也提示著microRNAc- 34家族可能作為分子靶向治療的重要部分為肝細胞肝癌的診療帶來幫助[9]。本研究發現，肝癌組織中microRNA- 34c在表達明顯下降，其預測靶基因c-Met表達增多，二者表達呈負相關。細胞實驗中證實，microRNA- 34c可抑制c-Met的表達。前期研究表明，c-Met過表達會持續激活肝細胞生長因子HGF/c-Met通路，促進腫瘤的發展[10- 11]。最新研究表明，抑癌基因P53可以調控microRNAc- 34的表達[12]。本實驗結果證明，肝癌細胞中過表達microRNA- 34c及干擾c-Met表達均可增加P53的表達量。目前，microRNA動物實驗的研究比較少，本研究通過裸鼠成瘤模型的建立和瘤內注射后腫瘤體積的測量發現，microRNA- 34c在一定程度上可以抑制體內肝癌細胞的生長。綜上所述，microRNA- 34c在肝癌組織中表達下調，在肝癌細胞中抑制c-Met的表達并且增加P53的表達。同時，microRNA- 34c可在小鼠體內抑制肝癌細胞生長。本研究為microRNAc- 34作為未來分子靶向治療的可能提供了一定的理論依據。以后的工作中，可以進一步探討microRNA- 34c調節c-Met對原發性肝癌侵襲及轉移機制的影響，明確microRNA- 34c在原發性肝癌發生發展中的作用。

圖2 臨床肝癌組織與相應癌旁組織中c-Met蛋白的表達Fig 2 The expression of c-Met protin in clinical liver cancer tissues and related normal tissues

*P<0.01 compared with control圖3 Hepg2.2.15細胞系轉染microRNA- 34c后c-Met的表達量Fig 3 The expression of c-Met in Hepg2.2.15 cell lines tansfected with microRNA- 34c plasmid

圖4 microRNA- 34c質粒及c-Met干擾RNA轉染Hepg2.2.15細胞系后P53的表達Fig 4 The expression of P53 in Hepg2.2.15 cell lines transfected with microRNA- 34c plasmid or c-Met siRNA respectively

圖5 瘤內注射后3組移植腫瘤體積大小的比較Fig 5 Comparion of transplanted tumor size after intratumor injection

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microRNA- 34c suppressesdevelopment of hepatocellular carcinoma by downregulating c-Met

YU Xiao-jian，WANG Yan，LI Rui-feng，LI Li，LIU Yu-gang*

(Dept. of Pathophysiology，School of Medicine，Shandong University，Jinan 250012，China)

ObjectiveTo study the effect of microRNA- 34c on the development of hepatocellular carcinoma.MethodsExpressions of microRNA- 34c and c-Met protein in clinical hepatocellular carcinoma tissue and para-carcinoma tissue, c-Met mRNA and protein in HepG2.2.15 cells transfected with microRNA- 34c, P53 protein in HepG2.2.15 cells transfected with microRNA- 34c or c-Met siRNA were detected by qPCR and Western blot respectively. Xenograft nude mice with liver cancer was established and the volume of tumors was measured.ResultsMicroRNA- 34c expression was significantly decreased in the hepatocellular carcinoma tissue compared with para-carcinoma tissue(P<0.01),while the c-Met expression was inverse.MicroRNA- 34c can inbit c-Met expression in HepG2.2.15 cells(P<0.01).Downregulation of c-Met ehanced P53 activity(P<0.05).MicroRNA- 34c inhibited the growth of liver cancer in xenograft nude mice modle(P<0.05).ConclusionsMicroRNA- 34c may play a role in suppressing the development of hepatocellular carcinoma by downregulating c-Met.

hepatocellular carcinoma；microRNA- 34c；c-Met；P53

2014- 01- 13

2014- 03- 28

*通信作者(correspondingauthor)：liuyugang@sdu.edu.cn

1001-6325(2014)09-1250-05

R 575.1

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