環孢素A改善創傷失血性休克大鼠血管及器官功能

雷 艷，董兆君

(第三軍醫大學1.衛勤訓練基地醫學綜合教研室;2.軍事預防醫學院毒理學研究所，重慶400038)

線粒體通透性轉換孔(mitochondrial permeability transition pore，MPTP)是線粒體膜上的重要的通道結構，在缺血缺氧和再灌注引起的器官功能損害中有重要作用［1－2］。環孢素A(cyclosporin A，CsA)是目前發現的特異性MPTP 關閉劑，能夠通過抑制MPTP 開放發揮對缺血再灌注心臟的保護作用［3］。筆者曾發現，CsA 對創傷失血性休克動物有較好的治療作用，能有效改善休克后的酸中毒狀態［4］。嚴重創傷休克后血管功能障礙是影響休克患者組織灌注不足和隨后發生的器官功能障礙的關鍵因素［5－6］。但CsA 能否改善休克后血管功能，改善組織灌注，發揮對器官功能的保護作用，目前尚不清楚。本實驗采用大鼠創傷失血性休克模型，觀察不同劑量CsA 對休克動物血管收縮/舒張功能的影響，同時觀察CsA 對肝、腎重要器官血流量、肝腎功能及線粒體功能的影響，以探討CsA發揮對休克動物保護作用的途徑。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與試劑

清潔級SD 大鼠48 只，體質量180 ～220 g，雌雄各半［第三軍醫大學大坪醫院實驗動物中心提供，合格證號SCXK(渝)2007-0005］。CsA、二磷酸腺苷(ADP)、乙酰膽堿(Sigma 公司)，天冬氨酸氨基轉移酶(AST)檢測試劑盒、丙氨酸氨基轉移酶(ALT)檢測試劑盒、血尿素氮(BUN)檢測試劑盒、血肌酐(CREA)檢測試劑盒(Bechman 公司)。其他試劑均為國產分析純。

1.2 創傷失血性休克大鼠模型建立及實驗分組

復制創傷失血性休克模型［6］:大鼠右側股動脈及股靜脈插管，通過股動脈插管放血使血壓降至40 mmHg，并維持3 h，折斷左側股骨。大鼠隨機分為6 組(n =8):對照組、休克組、乳酸林格氏液(LR)復蘇組、CsA 1、5 和10 mg/kg 組。休克模型完成后按照分組進行復蘇:LR 組給予2 倍失血量的LR 輸注，CsA 組在LR 中加入不同劑量的CsA 輸注;休克組在休克模型完畢后不復蘇;對照組僅插管、不放血、不復蘇。在復蘇后2 h，檢測各項功能指標。

1.3 肝/腎血流量和肝/腎功能檢測

將大鼠行剖腹手術，通過激光多普勒血流監測儀(PeriFlux System 5000)測定肝/腎的血流量［7］。從股動脈抽血，用全自動生化分析儀(Beckman)測定肝腎功能，包括AST、ALT、BUN 和CREA［7］。

1.4 血管收縮/舒張反應性測定

采用離體血管環張力測定技術［6］，記錄血管在梯度濃度去甲腎上腺素(norepinephrine，NE，1×10－9、1×10－8、1×10－7、1 ×10－6和1 ×10－5mol/L)下的收縮力(收縮反應性用NE 誘導血管收縮力與124 mmol/L的高K+誘導的預收縮力的百分比表示)［8］。隨后記錄血管對不同濃度的乙酰膽堿(acetylcholine，ACh，1 ×10－9、1 ×10－8、1 ×10－7、1 ×10－6和1 ×10－5mol/L)的舒張反應性(以加入ACh 后血管環收縮力減少的百分比反映)。

1.5 線粒體功能檢測

提取肝、腎和小腸的線粒體，通過溶氧儀(MT 200)測定在有ADP 刺激下(3 態呼吸)和無ADP 刺激下(4 態呼吸)的氧氣消耗量，以呼吸控制率(RCR，即3 態呼吸耗氧率和4 態呼吸耗氧率的比值)來反映線粒體功能［6］。

1.6 統計學分析

2 結果

2.1 CsA 對創傷失血性休克大鼠血管收縮/舒張功能的影響

休克后大鼠腸系膜上動脈對NE 誘導的血管收縮反應明顯降低(P＜0.01)。LR 組大鼠的血管收縮功能有輕度回升，但仍顯著低于對照組。CsA 輸注可使休克大鼠血管收縮功能明顯恢復，其中CsA 5 和10 mg/kg 組血管最大收縮反應明顯高于LR 組(P＜0.01)(圖1)。CsA 也明顯恢復了休克后降低的血管舒張反應性，CsA5 mg/kg 組血管最大舒張反應性明顯高于LR 組(P＜0.05)(圖2)。

圖1 NE 誘導的收縮反應的量效曲線Fig 1 Effects of CsA on the concentration-response curve for NE(1 ×10 －9 ～1 ×10 －5 mol/L)in SMA of rats after traumatic hemorrhagic shock(% of the contraction produced by 124 mmol/L K +，±s，n=8)

2.2 CsA 對創傷失血性休克大鼠器官血流量的影響

與對照組相比，休克后大鼠肝及腎的血流量均顯著降低(P＜0.01)。5 mg/kg 和10 mg/kg 的CsA輸注可明顯恢復器官血流量，明顯高于LR 組(P＜0.01，P＜0.05)(表1)。

2.3 CsA 對創傷失血性休克大鼠肝腎功能的影響

休克后肝、腎功能的重要指標都明顯升高，包括AST、ALT、BUN 和CREA(P＜0.01)。與LR 組相比，CsA(1 和5 mg/kg)可明顯降低休克大鼠血漿中ALT 和CREA 的水平(P＜0.01，P＜0.05)。但LR和CsA 對AST 和BUN 無明顯影響(表2)。

圖2 ACh 誘導的舒張反應的量效曲線Fig 2 Effects of CsA on the concentration-response curve for ACh(1 ×10 －9 ～1 ×10 －5 mol/L)in SMA of rats after traumatic hemorrhagic shock(±s，n=8)

表1 CsA 對創傷失血性休克大鼠器官血流量的影響Table 1 Effects of CsA on blood flow in the liver and kidney after traumatic hemorrhagic shock(±s，U/min，n=8)

表1 CsA 對創傷失血性休克大鼠器官血流量的影響Table 1 Effects of CsA on blood flow in the liver and kidney after traumatic hemorrhagic shock(±s，U/min，n=8)

*P＜0.01 compared with sham group;#P＜0.05，##P＜0.01 compared with LR group．

groupliverkidney sham614 ±53302 ±29 shock356 ±58*67 ±15*LR328 ±65132 ±34 CsA 1 mg/kg413 ±47189 ±28#CsA 5 mg/kg444 ±50##224 ±48##CsA 10 mg/kg428 ±55#192 ±24#

2.4 CsA 對創傷失血性休克大鼠器官線粒體功能的影響

休克也使肝、腎、腸的線粒體功能明顯降低(P＜0.01)。LR 復蘇后各器官線粒體功能無明顯改改善。CsA 5 mg/kg 輸注能明顯改善各器官的線粒體功能，其作用明顯優于單用LR 復蘇(P＜0.01)(表3)。

表2 CsA 對創傷失血性休克大鼠肝腎功能的影響Table 2 Effects of CsA on the liver and kidney function after traumatic hemorrhagic shock (±s，n=8)

表2 CsA 對創傷失血性休克大鼠肝腎功能的影響Table 2 Effects of CsA on the liver and kidney function after traumatic hemorrhagic shock (±s，n=8)

*P＜0.01 compared with sham group;#P＜0.05，##P＜0.01compared with LR group．

groupAST(U/L)ALT(U/L)BUN(mmol/L)CREA(μmol/L)sham138 ±5833.2 ±5.16.7 ±0.826.7 ±3.7 shock424 ±59*71.6 ±9.6*13.2 ±1.3*72.6 ±9.3*LR411 ±6385.0 ±10.612.9 ±0.662.8 ±7.1 CsA 1 mg/kg454 ±9458.6 ±9.8##12.3 ±1.347.3 ±11.6#CsA 5 mg/kg405 ±7464.7 ±8.2##12.2 ±1.646.7 ±9.3#CsA 10 mg/kg513 ±4587.7 ±19.513.1 ±0.958.2 ±1 4.8

表3 CsA 對創傷失血性休克大鼠器官線粒體功能的影響Table 3 Effects of CsA on the mitochondrial function(RCR)in the liver，kidney and intestine after traumatic hemorrhagic shock (±s，n=8)

表3 CsA 對創傷失血性休克大鼠器官線粒體功能的影響Table 3 Effects of CsA on the mitochondrial function(RCR)in the liver，kidney and intestine after traumatic hemorrhagic shock (±s，n=8)

*P＜0.01 compared with sham-operated group;#P＜0.01 compared with LR group．

groupliverkidneyintestine sham6.58 ±1.195.61 ±0.927.38 ±1.34 shock3.45 ±0.91*3.51 ±0.73*3.73 ±0.38*LR3.39 ±0.593.13 ±0.854.20 ±0.86 CsA 1 mg/kg5.21 ±0.825.21 ±1.33#6.50 ±1.42#CsA 5 mg/kg6.11 ±1.23#5.40 ±0.60#6.70 ±1.21#CsA 10 mg/kg4.07 ±1.553.54 ±1.314.94 ±1.50

3 討論

血管低反應性是嚴重創傷休克及膿毒癥等臨床重癥患者常出現的一種血管功能障礙，是導致嚴重器官功能損害甚至患者死亡的重要原因［6］。前期研究發現，MPTP 的關閉劑CsA 能明顯改善休克動物的存活狀態，并糾正休克后的酸中毒狀態［4］。CsA 是一種免疫抑制劑，廣泛用于治療器官移植后的排斥反應，近來研究發現它能有效地抑制MPTP的開放，對缺血再灌注后心、腦損傷有較好的保護作用［3］。但CsA 對休克后血管低反應性的作用及其與器官功能的關系，目前尚少見報道。本研究顯示CsA 可明顯恢復休克后降低的血管收縮/舒張功能，其中5 mg/kg 的CsA 效果最為明顯。CsA 5 mg/kg對肝及腎組織血流量、肝腎功能和線粒體功能也有明顯改善作用。提示CsA 除了對缺血再灌注損傷的心肌有保護作用，還可通過恢復休克后血管反應性，改善重要器官的血流灌注，改善器官功能和線粒體功能，來發揮抗休克作用。

在本實驗中也發現，CsA 10 mg/kg 也可改善休克血管功能和器官血流量，但對于肝腎功能及線粒體功能，其作用與單用LR 無明顯差異，提示CsA 劑量增加并未提高其治療作用。有研究顯示高劑量CsA 可能引起嚴重的不良反應［9］。因此，合適的CsA 使用劑量需更多的實驗來驗證。根據本結果，CsA 5 mg/kg 可能是合適的劑量。

以上結果顯示，CsA 對休克后血管的收縮和舒張功能都有明顯的恢復作用，并可提高組織器官的血流灌注，改善器官和線粒體功能，發揮對創傷休克的治療作用。但是，CsA 作為免疫抑制劑，用于治療休克等臨床重癥時，是否會影響患者的免疫功能，尚需進一步研究。

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