與泌尿生殖竇間質細胞共培養誘導hUC-MSCs定向分化為前列腺上皮樣細胞

李 望，高維強

(上海交通大學醫學院附屬仁濟醫院干細胞研究中心，上海200127)

干細胞的生長和分化、成熟與周圍的微環境有關［1］。可能的機制是，干細胞在特定的微環境中受到周圍細胞信號的影響，從而對新的微環境中的調節信號做出反應。例如神經干細胞在神經系統內幾乎不增殖，只有當神經出現損傷時，才有可能被激活［2］。有研究表明［3］，心臟干細胞平時也不具有增殖能力，只有在特定的時候才會增殖分化。人的間充質干細胞(mesenchymal stem cells，MSCs)是多潛能的細胞［4］。許多研究報道，這類細胞能夠分化成不同類型的細胞，例如可以分化成中胚層的組織包括骨、軟骨、肌肉、韌帶、肌腱和脂肪［5］。近年來人的臍帶間充質干細胞(human umbilical cord-derived mesenchymal stem cells，hUC-MSCs)成為研究的熱點。由于hUCMSCs 具有組織樣本容易獲得、非侵入性的采集過程、并且采集臍帶沒有倫理道德上的爭議，人們認為hUC-MSCs 是比較原始的細胞且干性更強，比其他組織的MSCs 免疫排斥性低，并且具有更強的可塑性和擴增能力等優點［6］。本研究的目的是想探索hUCMSCs 在體外特定的組織細胞微環境中是否能夠被定向誘導分化成為前列腺上皮細胞。

1 材料與方法

1.1 材料

PE 偶聯的CD105、FITC 偶聯的CD29、APC 偶聯的CD31、Per-Cy5.5 偶聯的CD45 和PE-Cy7 偶聯的CD34(eBioscience 公司);P63、AR、CK8、PSA 及vimentin 抗體(Santa Cruz 公司);睪酮、膠原蛋白酶IV 和胰蛋白酶(Sigma 公司);isopore 膜(Millipore 公司);膠原蛋白(collagen 膠)(BD 公司)。

1.2 泌尿生殖竇間質細胞的制備

泌尿生殖竇間質細胞的分離過程根據以往的研究報道［7］。從懷孕18 d 的SD 大鼠身上取出胚胎，處死并取下胚胎的泌尿生殖竇。把泌尿生殖竇間質與上皮分離后，把間質組織用1 mg/mL 的膠原蛋白酶Ⅳ聯合0.125%的胰蛋白酶在37 ℃下消化30 min，將消化下來的細胞在改良Eagle 培養基(Dulbecco's Modified Eagle Medium，DMEM)中分散培養(DMEM 中加入10%胎牛血清，100 U/mL 青霉素和100 mg/mL 鏈霉素，10－8mol/L 雄激素)。大鼠泌尿生殖竇的間質細胞(rat urogenital sinus stromal cells，rUGSSs)長滿培養皿后用胰蛋白酶消化傳代，在培養基中培養兩周后與hUC-MSCs 聯合進行體外實驗。

1.3 hUC-MSCs 的分離和制備

新鮮的人臍帶從仁濟醫院產科的剖腹產手術中取得。獲得仁濟醫院倫理委員會的批準及取得了產婦及親屬同意。臍帶組織在70%的乙醇中消毒30 s并用0.9%氯化鈉注射液徹底清洗。反復清洗直到血和血凝塊洗凈。為了避免內皮細胞的污染，臍血管用0.9%氯化鈉注射液沖洗后用無菌的解剖刀切開。臍血管(動脈和靜脈)移除，將暴露的華通氏膠組織切成小片［8］。切碎成1 ～2 mm3的碎片后用1 mg/mL的膠原蛋白酶IV 聯合0.125%胰蛋白酶在37 ℃消化30 min。將消化之后的細胞用400 ×g 離心8 min，在PBS 中洗2 次。華通氏膠中提取的細胞放在含有8% 胎牛血清、100 U/mL 青鏈霉素的DMEM 培養基中培養。hUC-MSCs 在長滿培養皿后傳代，細胞在體外培養兩周后與大鼠的泌尿生殖竇間質細胞聯合進行體外實驗。

1.4 流式細胞鑒定

使用標準的流式技術分析第4 代hUC-MSCs 細胞。用單陽性對照調補償。細胞先標記CD105、CD29、CD45、CD34 和CD31 抗體后用BD FACSAria流式細胞儀分析細胞的純度。

1.5 體外分化

hUC-MSCs 與大鼠的泌尿生殖竇的間質細胞混合，重懸在3 g/L 100 μL collagen 膠原蛋白中。將含有細胞的膠原蛋白放置在isopore 膜上(圖3A，B，C)。把膜放在盛有DMEM 培養基的培養皿中培養，加睪酮終濃度在10－8mol/L(0.01 μmol/L)，每3 天更換新的培養基。兩周后收集膠原蛋白并且將其做免疫熒光分析。用前列腺上皮細胞的標志物分析hUC-MSCs 的分化。

2 結果

2.1 hUC-MSCs 和大鼠的泌尿生殖竇的間質細胞的分離和鑒定

通過膠原蛋白酶聯合胰蛋白酶消化的方法，由人臍帶而來的細胞以1 000 個細胞/cm2的密度種在培養皿中。貼壁細胞呈現典型的成纖維狀或多角形的形態學特征(圖1A)。泌尿生殖竇的間質細胞較小并且呈成纖維狀的外觀(圖1B)。

為了再次鑒定制備的hUC-MSCs，利用流式分析第4 代細胞。如圖2，hUC-MSCs 表達CD29(圖2D)、CD105(圖2E)，但對于造血譜系的標志物CD34 陰性(圖2F)，白細胞共同抗原CD45(圖2G)陰性，血小板、內皮細胞黏附分子CD31 陰性(圖2H)。流式分析得出CD29、CD105 雙陽性的hUCMSCs 群體占整體的98.7%(圖2C)。

圖1 人臍帶間充質干細胞和大鼠泌尿生殖竇間質細胞的形態特征Fig 1 The morphology and characterization of human umbilical cord-derived mesenchymal stem cells(hUC-MSCs)and rat urogenital sinus mesenchymal cells(rUGSSs)(×40)

2.2 hUC-MSCs 在體外分化

hUC-MSCs 與大鼠的泌尿生殖竇的間質細胞聯合在三維立體膠中體外培養(圖3A，B，C)，經睪酮誘導兩周后將培養的細胞做免疫熒光分析顯示，一些細胞表達前列腺上皮的標志物。包括基底細胞的標志物CK5(圖3E)和P63(圖3F)、腔細胞的標志物CK8(圖3D)。這些發現提示，hUC-MSCs 在體外特異的組織細胞微環境中能夠定向分化。

3 討論

在正常的胚胎發生當中，前列腺是由泌尿生殖竇發育而來，泌尿生殖竇起源于泄殖腔的分叉。泌尿生殖竇是一個正中線的結構，由內胚層起源的上皮層和中胚層起源的基質細胞層所構成［9］。前列腺的發育、生長和細胞分化是由上皮和周圍的間質微環境相互作用的結果［10］。在前列腺的發育、成熟過程中，雄激素的存在起了非常重要的作用［11］。這個過程包括間質誘導上皮的發育，以及上皮在發育過程中對間質的反作用。

干細胞存在于特定的微環境細胞中，微環境能夠給予干細胞營養并且保持組織細胞的穩態。當干細胞存在的微環境由于某種原因發生了改變，就會給干細胞發出某種信號刺激。例如發出細胞再生的刺激、分化的刺激、凋亡的刺激、或者其他的刺激最終導致干細胞不同的命運［12］。

圖2 流式細胞術檢測人臍帶間充質干細胞免疫表型Fig2 Immuno phenotypes of hUC-MSCs by flow cytometry

圖3 人臍帶間充質干細胞在體外分化Fig 3 Directed differentiation of hUC-MSCs in vitro(×100)

本研究中，利用rUGSSs 給hUC-MSCs 提供了增殖和分化的微環境，在雄激素的誘導作用下，在與rUGSSs 共培養的條件下分化出了前列腺上皮樣細胞?？赡芗毎盘柾吩诩毎脑鲋澈头只衅鹆酥匾慕巧Ｉ婕暗竭@個過程的信號分子還不太清楚。總之，本研究證明，利用hUC-MSCs 處于特異的組織細胞微環境中能夠定向分化成特定的細胞。利用這種方法可以快速地誘導分化出特定的細胞類型。為組織工程、基礎研究提供一個新的啟示。

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