小鼠CSE基因啟動子克隆及其活性測定

王茂先

(韓山師范學院生物學系，廣東潮州521041)

基因表達調控機制是后基因組時代一個重要的研究內容?；騿幼邮歉鞣N轉錄因子結合的區域，不同的轉錄因子對基因的表達調控起著不同的作用，基因的表達是這些轉錄因子共同作用的結果［1-2］。硫化氫(hydrogen sulfide，H2S)是一種具有臭雞蛋味道的有毒氣體，也是繼一氧化碳(NO)和一氧化氮(CO)之后的第3 種氣體信號分子［3-5］。硫化氫是新近發現的繼NO 和CO 后的第3 個內源性氣體信使，有多生物學功能，如它參與低氧性肺動脈高壓、感染性休克、急性肺損傷等多種疾病的病理生理過程［6-10］。胱硫醚γ-裂解酶(cytathiohine γ-lyase，CSE)是人類和哺乳動物細胞利用半胱氨酸或者同型半胱氨酸生成H2S 的3 種酶之一，另外兩種酶是胱硫醚β-合成酶(cytathiohine β-synthase，CBS)和3-硫基丙酮酸硫基轉移酶(3-mercaptopyruvate sulfurtransferase，3MST)［11-14］。許多研究表明，H2S/CSE 可能涉及大量諸如心肌缺血、動脈硬化、高血壓等心血管疾病的病理生理過程［15］。因此，研究胱硫醚γ-裂解酶基因啟動子與基因表達調控的關系具有重要的意義，不但可以闡明相關疾病發生的分子機制，而且有可能找到相關疾病治療的藥物新靶標。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

血液基因組DNA 小量抽提試劑盒(Axygen 公司)。DNA 凝膠回收試劑盒、質粒小量提取試劑盒和質粒中量提取試劑盒I(Biomiga 公司)。Trans5α感受態細胞、1 kb DNA Ladder Marker、Trans 2 kb DNA Marker、Trans 2 kb Plus II DNA Marker、Trans 8 kb DNA Marker 等DNA Marker (北京全式金生物技術有限公司)。LA Taq、dNTP mix、XhoⅠ和KpnⅠ限制性內切酶、堿性磷酸酶(BAP，含該酶的相關buffer)、T4 DNA Ligase 等試劑(TaKaRa 公司)。pGL4.12 質粒、Dual-Luciferase? Reporter Assay System 試劑盒(Promega 公司)。Xfect? 轉染試劑盒(Clontech 公司)。DEME(高糖，不含丙酮酸鈉)、RPMI-1640、DMEM/F12 1∶1 培養基、1 ×DPBS(不含鈣、鎂、酚紅)、1 ×0.25%胰蛋白酶/EDTA、南美胎牛血清、L-谷氨酰胺溶液(200 mmol/L)、青霉素/鏈霉素溶液(10 000 U/L 青霉素，10 000 μg/L 鏈霉素，溶于0.9%氯化鈉注射液)等細胞培養相關的試劑［賽默飛世爾科技(中國)有限公司］。HEK-293 細胞和COS-7細胞兩種哺乳動物細胞系［中國科學院上海生科院細胞資源中心)。成年昆明小鼠/Slac(25 ～30 g)(清潔級，性別隨機，動物合格證號SCXK(滬)2003-0003 號，上海斯萊克實驗動物有限公司］。

1.2 實驗方法

1.2.1 小鼠基因組DNA 提取:取小鼠眼底血，收集4.5 ×10－4L 昆明小鼠的血液，加入5 ×10－5L 質量百分數為8%的檸檬酸鈉溶液。運用血液基因組DNA 小量抽提試劑盒，抽提小鼠DNA 基因組。具體步驟，詳見試劑說明書，1% 瓊脂糖凝膠電泳鑒定(圖1A)。在GenBank 數據庫中搜索到小鼠CSE 基因啟動子的序列，設計上下游引物，目標片段DNA長1 716 bp(－1691 ～+25 nt)。

1.2.2 引物設計、PCR 擴增、連接pGL4.12 載體測序:根據GenBank 數據庫中小鼠CSE 基因啟動子序列(AC_000025.1)，用Primer Premier 5.0 軟件設計特異性PCR 引物(表1)，CSE 基因啟動子引物為F 和R，下劃線序列為限制性酶切位點，上游為KpnⅠ，下游為XhoⅠ，引物由上海博尚生物技術公司合成。應用LA Taq，以小鼠基因組DNA 為模板進行CSE 5'側翼區片段PCR 擴增，反應體積為5 ×10－5L，反應條件為:94 ℃3 min，94 ℃30 s，56 ℃30 s，72 ℃2 min 30 s，進行30 個循環，然后72 ℃10 min，4 ℃保存。擴增產物經1%瓊脂糖電泳鑒定，DNA 膠回收試劑盒回收純化。將克隆的小鼠CSE 基因5'側翼區片段命名為KM1716，連接到pGL4.12 載體上，構建重組載體命名為pGL4.12-KM1716，連接產物轉化到Trans 5α感受態細胞中，37 ℃培養過夜，挑取單菌落，37 ℃搖床培養過夜。高純度質粒小提試劑盒抽提質粒后進行限制性酶切分析，經鑒定片段大小正確后，送至上海博尚生物技術公司測序，測序結果與GenBank 數據庫中的公布序列比對分析。

表1 PCR 引物信息Table 1 The primer's information of PCR

1.2.3 小鼠CSE 基因啟動子生物信息學:分析對克隆測序獲得的小鼠CSE 基因5'側翼區域利用啟動子在線預測與分析軟件Neural Network Promoter Prediction(http://fruitfly．org:9005/seq_tools/promoter．html)、Promoter 2.0 Prediction Server(http://www．cbs．dtu．dk/services/Promoter/)和McPromoter(http://tools．genome．duke．edu/generegulation/Mc-Promoter/)預測并分析啟動子區。最后結合文獻報道并應用CpG island 預測軟件CpG Island Searcher(http:/ /www．uscnorris．com/cpg-islands2/cpg．aspx)和在線軟件TFSEARCH(http://mbs．cbrc．jp/research/db/TFSEARCH．html)分析預測CpG 島和一些轉錄因子結合位點。

1.2.4 pGL4.12-KM1716 熒光蛋白報告載體的構建和細胞培養:用KpnⅠ和XhoⅠ，對pGL4.12 和KM1716 雙酶切后，分別膠回收線性pGL4.12 和KM1716 片段，并用T4 DNA Ligase 16 ℃過夜連接，連接產物轉化Trans 5α 感受態細胞，37 ℃培養過夜，挑取單菌落，37 ℃搖床培養過夜。高純度質粒小提中量試劑盒抽提質粒后，進行限制性酶切鑒定。送至上海博尚生物技術公司測序，經鑒定亞克隆的片段正確后，用于后續的實驗中。

野生型的HEK-293 細胞和轉染有pGL4.12-KM1716 的HEK-293 細胞培養在含有10%胎牛血清、10 ×105U/L penicillin G、100 g/L streptomycin、6.5 mmol/L L-glutamine 的高糖DMEM 培養液中，37 ℃、5% CO2、飽和濕度培養。野生型的COS-7 細胞和轉染有pGL4.12-KM1716 的COS-7 細胞培養在含有10% 胎牛血清、10 ×105U/L penicillin G、100 g/L streptomycin、4.05 mmol/L L-glutamine 的RPMI 1640 培養液中，37 ℃、5% CO2、飽和濕度培養。

1.2.5 pGL4.12-Km1716 在HEK193 細胞和COS-7細胞中的表達:轉染前1 d，將生長狀態良好的HEK-293 細胞和COS-7 細胞，用胰蛋白酶消化制成單細胞懸液，調整細胞數為2 ×105/孔，接種至3.5 cm 培養皿中，繼續培養。次日等細胞匯合率達90%時進行瞬時轉染，具體步驟，詳見試劑說明書。轉染后的細胞在24 h 后，HEK-293 細胞和COS-7 細胞后，測定螢火蟲螢光素酶和海腎熒光素酶的活性。熒光強度采用Dual-Luciferase? Reporter Assay 試劑在SpectraMax? microplate reader 儀器進行測定螢火蟲和海腎熒光素酶的活性，用倍數關系表示CSE 基因啟動子的相對活性。

2 結果

2.1 小鼠CSE 基因5'側翼區的擴增

昆明小鼠/Slac 血液基因組DNA，在1.0% 瓊脂糖凝膠電泳檢測中，出現單一條帶(圖1A)。PCR產物出現單一的目的條帶，片段大小與預期相符，為1 716 bp(圖1B)。酶切后的pGL4.12-KM1716 重組質粒，在電泳圖譜中，出現兩條單一條帶(1.7 kb 和4.4 kb)，分別為CSE 基因啟動子片段和pGL4.12空載(圖1C)。測序后，經過比對，確定為小鼠CSE基因5'側翼區序列，并且與GenBank 數據庫中報道的序列同源性為99%。

圖1 小鼠CSE 基因啟動子的克隆及重組質粒的鑒定Fig 1 Identification of recombinant plasmid and cloning of CSE gene promoter

2.2 小鼠CSE 基因啟動子的生物信息學分析

運用CpG 在線預測工具(http:/ /www．uscnorris．com/cpg-islands2/cpg．Aspx)分析，發現所擴增小鼠CSE 基因啟動子沒有符合條件的CpG 島，得到該序列中堿基C 和G 的含量之和為48.95%。在線預測工具TFSEARCH(http://mbs．cbrc．jp/research/db/TFSEARCH．html)分析得知，CSE 基因啟動子上的轉錄因子結合位點檢測分值在92 分以上的有25個。其中，GATA 結合因子(GATA-binding factor，GATA)有4 個，SRY 有3 個，上游刺激因子(upstream stimulatory factor，USF)有2 個，髓鋅指蛋白1(myeloid zinc finger protein 1，MZF1)有2 個，含有MYB 結構域的一類轉錄因子(v-Myb)有2 個，CdxA有2 個，TATA 盒(TATA box)有1 個，急性髓系白血病-1a(Acute myeloid leukaemia-1a，AML-1a)有1個，RORalp 有1 個，C/EBP 有1 個，Nkx-2 有1 個，Lyf-1 有1 個，N-Myc 有1 個，熱休克因子2(heat shock factor 2，HSF2)有1 個，E2F 有1 個。CSE 基因啟動子的生物信息學分析結果(表2)。

表2 CSE 基因啟動子的生物信息學分析Table 2 Results of the bioinformatics analysis of CSE gene promoter

2.3 小鼠CSE 啟動子的活性測定

報告基因分析是通過瞬時轉染培養在細胞培養基中的來進行的。用倍數關系表示CSE 基因啟動子的相對活性。檢測結果發現，pGL4.12-KM1716 在HEK-293 細胞和COS-7 細胞中表達的活性，與空載體pGL4.12 在兩種細胞中的活性相比，分別是17.6±2.1 倍和12.4±1.2 倍(圖2)。結果表明，KM1716 片段具有CSE 核心啟動子的轉錄調節活性，能夠用于哺乳動物細胞CSE 轉錄和表達調控方面的研究。

圖2 pGL4.12-KM1716 在HEK-293 細胞和COS-7細胞中表達的相對活性Fig 2 Relative activity of expression of pGL4.12-KM1716 in HEK-293 and COS-7 cells(±s，n=4)

3 討論

近年來，內源性硫化氫在神經系統、心血管系統等方面的生理作用，主要表現為參與一些疾病的病理過程，同時，其在藥物開發的前景等方面也越來越引起人們的重視［8］。硫化氫在各種心血管組織中，主要經胱硫醚γ-裂解酶催化內源性生成。在體循環血管、肺循環血管及其他血管組織中起著舒張血管、促進血管新生、抑制血管平滑肌細胞增殖并調控其表型轉化等生物學效應［9］。通過轉染的HEK-293 細胞研究發現，小鼠CSE 基因核心調控區包括5'側翼區近端375 bp 的啟動子區(－357 ～+18)［14］。運用pGL3 螢光素酶報告基因技術，研究了CSE 基因啟動子3.5 kb(－3 498 ～+18)瞬時轉染在RAW264.7 細胞中的活性。發現LPS 處理RAW264.7 細胞后，CSE 基因啟動子活性隨LPS 濃度梯度的變化而升高，但是地塞米松抑制這種效應［13］。pGL4.12-KM1716 表達載體在HEK-293 細胞和COS-7 細胞中都具有很強的螢光素酶的活性(圖2A，B)，這表明小鼠CSE 基因近端啟動子在不同的哺乳動物細胞(人和小鼠等)中具有調控CSE 基因轉錄和表達的能力。同時，發現小鼠CSE基因啟動子(－1 691 ～+25)存在一些重要的轉錄因子結合位點，如TATA 盒、GATA、HSF2 等，這些轉錄因子結合位點可能對于CSE 基因的轉錄和表達調控起著重要的作用。CSE 啟動子上MZF-1 和Sp1 結合位點發生突變，能夠顯著地影響轉染在HEK-293細胞和COS-7 細胞中CSE 基因啟動子的活性，表明這些轉錄因子涉及到基本轉錄活性。相反地，移除AML-1a、USF-1 和N-Myc 轉錄因子結合位點共有序列，能夠增加HEK-293 細胞中CSE 基因啟動子活性，這表明這些轉錄因子具有作為抑制元件而起作用的［14］。

在心血管、炎性反應等方面的疾病治療性研究方面，CSE 基因啟動子的研究工作具有其優越性。本研究獲得的CSE 基因啟動子具有啟動螢光素酶基因的表達能力，這為進一步CSE 基因轉錄調控機制的研究奠定了實驗和理論基礎。特別要強調的是，CSE 基因啟動子上一些重要的轉錄因子的可能結合位點，存在重要的臨床研究價值(如作為藥物的作用靶標等)，有利于深入研究其生物學功能和醫藥方面的重要作用。

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